科佰迪Vero残留DNA片段分布检测试剂盒说明书

科佰迪Vero残留DNA片段分布检测试剂盒说明书
产品介绍

      Vero残留DNA 片段分布检测试剂盒基于PCR 荧光探针法,设计了三种不同大小的扩增片段(85bp,172bp,230bp)进行定量分析检测生物制品样本中Vero 残留DNA 片段的分布情况。该检测具有性能可靠、灵敏高效、特异性强等特点,并且其检测限可低至fg 级水平。Vero 残留DNA 片段分布检测试剂盒可用于定量分析检测各类复杂生物制品的中间品及成品中Vero 残留DNA 片段的分布情况。

  • 货号:BQ-RDSD-004

  • 规格:3X100反应

科佰迪bio-quality

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,专一快速的检测Vero细胞的残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平。试剂盒本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

41303ES5050T

41303ES60(100T)

41303-A

Vero qPCR mix

0.8 mL

1.6 mL

41303-B

Vero Primer&probe mix

200 μL

400 μL

41303-C

DNA Dilution Buffer

2×2 mL

4×2 mL

41303-D

Vero DNA Control30 ng/μL

25 μL

50 μL

【注】本试剂盒不含ROX 参比染料,若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料,推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye(Cat#10200ES)

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输,-20℃保存,有效期2年。

2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

Thermo Scientific:ABI 7500;ABI Quant Studio 5;ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、Vero DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL。

具体操作如下:

1. 将试剂盒中的DNA定量参考品DNA稀释液置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

2. 取7支净的1.5 mL离心管,分别标记为3 ng/μL,

3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA 稀释液和10 μL DNA 定量参考品30 ng/μL),即稀释3 ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。

4. 在 管中先分别加入90 μL DNA稀释液,再进行梯度稀释,稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

3 fg/μL

【注】

1. 每个浓度做3个复孔该试剂可测试3 fg/μL-300 pg/μL线性范围需要,可适当扩大缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于20℃

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天,长时间不用请放置于20℃

4. 为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀1 min。

二、样本回收质控QC的制备

根据需要设QC中的Vero DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例),具体操作如下

  1. 100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL溶液,混匀,标记为样本加标回收QC。
  2. 回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备(可选)

根据需要设QC中的Vero DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例),具体操作如下:

  1. 100 μL 溶液加入1.5 mL的离心管中标记为标准品回收QC
  2. 标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备标准品回收QC纯化液。

、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控,具体操作如下:

  1. 100 μL样本基质溶液(或DNA 稀释液)加入1.5 mL的离心管中,标记为阴性质控NCS
  2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液

无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

  1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
  2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液(即16 μL Vero qPCR mix + 4μL Vero Primer&probe mix) + 20 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

、反应体系

组分

体积(μL

Vero qPCR mix

16

Vero Primer&probe mix

4

DNA template

20

总体积

40

 

【注】

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液 =(反应孔数+2)× (16+4) μL(含有2孔的损失量)。通常每个样本做3个重复孔。

2. 加样完成密封好管子后,请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

下图为参考板位:

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

该示例是对Vero残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:1个无模板对照NTC、6个浓度梯度的DNA标准曲线、3个样本加标回收QC即加样回收QC)3个待测样本3个标准品回收QC(可选)3个阴性质控NCS1个即可建议每个样本3个重复孔。

、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

  1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
  2. 创建1个检测探针,命名为Vero-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none
  3. Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity 一栏分别赋值为300000300003000300303(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL3 fg/μL;将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NCS孔、待测样本孔、样本加标回收QC孔的Task一栏设置为Unknown,并在相应Sample Name一栏中分别命名为NCSTSQC,之后点击Start Run开始仪器运行

     4. 扩增程序设置:设置反应体积40 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

预变性

95℃

10 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60℃

30 sec

qPCR 结果分析

1.在AnalysisAmplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold 至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在AnalysisStandard Curve面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)斜率(Slope)、截距(Intercept)。正常的标曲R²>0.99;扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内Slope在3.4左右

3. 在AnalysisView well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收QC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

 

HB221226

 

 

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

暂无内容

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

暂无内容

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,专一快速的检测Vero细胞的残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平。试剂盒本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

41303ES5050T

41303ES60(100T)

41303-A

Vero qPCR mix

0.8 mL

1.6 mL

41303-B

Vero Primer&probe mix

200 μL

400 μL

41303-C

DNA Dilution Buffer

2×2 mL

4×2 mL

41303-D

Vero DNA Control30 ng/μL

25 μL

50 μL

【注】本试剂盒不含ROX 参比染料,若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料,推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye(Cat#10200ES)

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输,-20℃保存,有效期2年。

2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

Thermo Scientific:ABI 7500;ABI Quant Studio 5;ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、Vero DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液将DNA定量参考品进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL。

具体操作如下:

1. 将试剂盒中的DNA定量参考品DNA稀释液置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

2. 取7支净的1.5 mL离心管,分别标记为3 ng/μL,

3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA 稀释液和10 μL DNA 定量参考品30 ng/μL),即稀释3 ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。

4. 在 管中先分别加入90 μL DNA稀释液,再进行梯度稀释,稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

3 fg/μL

【注】

1. 每个浓度做3个复孔该试剂可测试3 fg/μL-300 pg/μL线性范围需要,可适当扩大缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于20℃

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天,长时间不用请放置于20℃

4. 为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀1 min。

二、样本回收质控QC的制备

根据需要设QC中的Vero DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例),具体操作如下

  1. 100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL溶液,混匀,标记为样本加标回收QC。
  2. 回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备(可选)

根据需要设QC中的Vero DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例),具体操作如下:

  1. 100 μL 溶液加入1.5 mL的离心管中标记为标准品回收QC
  2. 标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备标准品回收QC纯化液。

、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控,具体操作如下:

  1. 100 μL样本基质溶液(或DNA 稀释液)加入1.5 mL的离心管中,标记为阴性质控NCS
  2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液

无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

  1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
  2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液(即16 μL Vero qPCR mix + 4μL Vero Primer&probe mix) + 20 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

、反应体系

组分

体积(μL

Vero qPCR mix

16

Vero Primer&probe mix

4

DNA template

20

总体积

40

 

【注】

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液 =(反应孔数+2)× (16+4) μL(含有2孔的损失量)。通常每个样本做3个重复孔。

2. 加样完成密封好管子后,请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

下图为参考板位:

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

该示例是对Vero残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:1个无模板对照NTC、6个浓度梯度的DNA标准曲线、3个样本加标回收QC即加样回收QC)3个待测样本3个标准品回收QC(可选)3个阴性质控NCS1个即可建议每个样本3个重复孔。

、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

  1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
  2. 创建1个检测探针,命名为Vero-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none
  3. Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity 一栏分别赋值为300000300003000300303(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL3 fg/μL;将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NCS孔、待测样本孔、样本加标回收QC孔的Task一栏设置为Unknown,并在相应Sample Name一栏中分别命名为NCSTSQC,之后点击Start Run开始仪器运行

     4. 扩增程序设置:设置反应体积40 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

预变性

95℃

10 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60℃

30 sec

qPCR 结果分析

1.在AnalysisAmplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold 至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在AnalysisStandard Curve面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)斜率(Slope)、截距(Intercept)。正常的标曲R²>0.99;扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内Slope在3.4左右

3. 在AnalysisView well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收QC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

 

HB221226

 

 

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

暂无内容

Vero细胞残留DNA检测试剂盒|Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit

暂无内容

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒 Vero Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒 Vero Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中不同长度的Vero残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,专一快速的检测200 bp以下及以上的Vero DNA残留,其定量限可以达到3 fg/μL水平且配套有Vero DNA Control(DNA定量参考品)。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

组分信息

组分编号

组分名称

41314ES70

41314ES74

41314-A

Vero qPCR Mix

0.75 mL×4管

1.5 mL×4

41314-B1

Vero Primer&Probe Mix-97

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-B2

Vero Primer&Probe Mix-154

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-B3

Vero Primer&Probe Mix-219

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-B4

Vero Primer&Probe Mix-507

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4管

41314-D

Vero DNA Control(30 ng/μL)

25 μL×1管

50 μL×1管

41314-E

IC

200 μL×1管

400 μL×1管

 

储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年其中A组分B1、B2、B3、B4组分需避光保存。

2. 收到货后,请检查共8个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. Vero DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

Vero片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段分别为:97 bp、154 bp、219 bp、507 bp。在建立标曲时,需分别对不同的扩增片段设置标曲,并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将Vero DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。具体操作如下:

1将试剂盒中Vero DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

26支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0Std1Std2Std3Std4Std5。

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Vero DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂是可以测试300 pg/μL-3 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-20℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 待测样本TS的制备

根据实验设置待测样本TS,具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,标记为TS,进行样本前处理,制备待测样本TS纯化液。

2)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的待测样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

3)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的NCS样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2每管或孔中NTC样本20 μL Mix混合液(即15 μL Vero qPCR Mix + 4 μL对应Vero Primer&Probe Mix + 1 μL IC+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

5. 反应体系

97 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-97

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

2 97 bp扩增片段的反应体系

154 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-154

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

3 154 bp扩增片段的反应体系

219 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-219

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

4 219 bp扩增片段的反应体系

507 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-507

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

5 507 bp扩增片段的反应体系

*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+4+1) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS)× 3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

97 bp

154 bp

219 bp

507 bp

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

B

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

C

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

D

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

E

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

F

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

G

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

H

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

6 上机参考板位

该示例是对Vero残留DNA各扩增片段分析的qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的Vero DNA标准曲线、1个待测样本TS1个阴性质控NCS、1个无模板对照NTC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2针对四种不同长度的扩增片段创建新检测探针分别命名为Vero-97Vero-154Vero-219Vero-507”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“none”;再创建1个检测探针,命名为“IC”,选择报告荧光基团为“CY5”,

猝灭荧光基团为“none”;检测参比荧光为ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”“30000”“3000”“300”“30”(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”“30 pg/μL”“3 pg/μL”“300 fg/μL”“30 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

45

退火(收集荧光)

60℃

30 sec

延伸

72℃

30 sec

7 扩增程序

7. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中进行单位换算。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

6无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35

 

Ver.CN20230515

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒 Vero Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit

暂无内容

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒 Vero Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit

暂无内容

 

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中不同长度的Vero残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,专一快速的检测200 bp以下及以上的Vero DNA残留,其定量限可以达到3 fg/μL水平且配套有Vero DNA Control(DNA定量参考品)。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

组分信息

组分编号

组分名称

41314ES70

41314ES74

41314-A

Vero qPCR Mix

0.75 mL×4管

1.5 mL×4

41314-B1

Vero Primer&Probe Mix-97

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-B2

Vero Primer&Probe Mix-154

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-B3

Vero Primer&Probe Mix-219

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-B4

Vero Primer&Probe Mix-507

200 μL×1管

400 μL×1管

41314-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4管

41314-D

Vero DNA Control(30 ng/μL)

25 μL×1管

50 μL×1管

41314-E

IC

200 μL×1管

400 μL×1管

 

储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年其中A组分B1、B2、B3、B4组分需避光保存。

2. 收到货后,请检查共8个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. Vero DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

Vero片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段分别为:97 bp、154 bp、219 bp、507 bp。在建立标曲时,需分别对不同的扩增片段设置标曲,并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将Vero DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。具体操作如下:

1将试剂盒中Vero DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

26支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0Std1Std2Std3Std4Std5。

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Vero DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂是可以测试300 pg/μL-3 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-20℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 待测样本TS的制备

根据实验设置待测样本TS,具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,标记为TS,进行样本前处理,制备待测样本TS纯化液。

2)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的待测样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

3)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的NCS样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2每管或孔中NTC样本20 μL Mix混合液(即15 μL Vero qPCR Mix + 4 μL对应Vero Primer&Probe Mix + 1 μL IC+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

5. 反应体系

97 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-97

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

2 97 bp扩增片段的反应体系

154 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-154

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

3 154 bp扩增片段的反应体系

219 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-219

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

4 219 bp扩增片段的反应体系

507 bp反应体系

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix-507

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

5 507 bp扩增片段的反应体系

*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+4+1) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS)× 3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

97 bp

154 bp

219 bp

507 bp

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

B

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

C

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

D

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

E

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

F

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

G

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

H

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

6 上机参考板位

该示例是对Vero残留DNA各扩增片段分析的qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的Vero DNA标准曲线、1个待测样本TS1个阴性质控NCS、1个无模板对照NTC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2针对四种不同长度的扩增片段创建新检测探针分别命名为Vero-97Vero-154Vero-219Vero-507”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“none”;再创建1个检测探针,命名为“IC”,选择报告荧光基团为“CY5”,

猝灭荧光基团为“none”;检测参比荧光为ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”“30000”“3000”“300”“30”(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”“30 pg/μL”“3 pg/μL”“300 fg/μL”“30 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

45

退火(收集荧光)

60℃

30 sec

延伸

72℃

30 sec

7 扩增程序

7. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中进行单位换算。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

6无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35

 

Ver.CN20230515

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒 Vero Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit

暂无内容

Vero宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒 Vero Host Cell Residue DNA Size Analysis Kit

暂无内容

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,可专一快速的检测Vero细胞的残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

组分信息

组分编号

组分名称

41307ES50

41307ES60

41307-A

Vero qPCR Mix

0.75 mL

1.5 mL

41307-B

Vero Primer&Probe Mix

200 μL

400 μL

41307-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4

41307-D

Vero DNA Control(30 ng/μL)

25 μL

50 μL

41307-E

IC*

50 μL

100 μL

*IC:Internal control,内部对照

 

储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年其中41307-A和41307-B均需避光保存。

2. 收到货后,请检查共5个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. Vero DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将Vero DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL3 fg/μL

具体操作如下:

1将试剂盒中Vero DNA Control定量参考品DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

27支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0,Std1,Std2,Std3,Std4,Std5Std6

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Vero DNA Control定量参考品Std0即稀释为3 ng/μL的浓度,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std1,Std2,Std3,Std4,Std5,Std6离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

Std6

10 μL Std5 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试300 pg/μL~3 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-20℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的Vero DNA标准品浓度(以制备加30 pg Vero DNAERC为例),具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL Std3,混匀标记为ERC

2回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加回收ERC纯化液。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2每管或孔中NTC样本20 μL Mix混合液(即15 μL Vero qPCR Mix + 5μL Vero Primer&Probe Mix+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

5. 反应体系

组分

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

2 标准品反应体系

*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+4+1) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)× 3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

ERC (Extraction Recovery Control):待测样本中加入如10 μL3 pg/μL标准品DNA后进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

 

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

 

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

 

 

 

B

NTC

 

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

 

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

 

 

 

C

NTC

 

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

 

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

 

 

 

D

 

 

 

 

 

 

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

 

 

 

E

NCS

 

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

 

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

 

 

 

F

NCS

 

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

 

标准曲线Std6

标准曲线Std6

标准曲线Std6

 

 

 

G

NCS

 

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

 

 

 

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 上机参考板位

该示例是对Vero残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:6个浓度梯度的Vero DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2创建2个检测探针,Target 1命名为Vero-DNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“none”Target 2命名为“IC”,选择报告荧光基团为“CY5”,猝灭荧光基团为“none”。参比荧光为“ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”“30000”“3000”“300”“30”“3”(含义为每孔DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“300 pg/μL”“30 pg/μL”“3 pg/μL”“300 fg/μL”“30 fg/μL”“3 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”,参比荧光勾选“ROX”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60℃

30 sec

4 扩增程序

7. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率,加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.pg)×100%。

6阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35

8)待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1,如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大,则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本,则优先考虑样本加标回收率结果,IC结果作为参考。

 

Ver.CN20230517

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)

暂无内容

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)

暂无内容

 

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的Vero残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,可专一快速的检测Vero细胞的残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

组分信息

组分编号

组分名称

41307ES50

41307ES60

41307-A

Vero qPCR Mix

0.75 mL

1.5 mL

41307-B

Vero Primer&Probe Mix

200 μL

400 μL

41307-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4

41307-D

Vero DNA Control(30 ng/μL)

25 μL

50 μL

41307-E

IC*

50 μL

100 μL

*IC:Internal control,内部对照

 

储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年其中41307-A和41307-B均需避光保存。

2. 收到货后,请检查共5个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. Vero DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将Vero DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL3 fg/μL

具体操作如下:

1将试剂盒中Vero DNA Control定量参考品DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

27支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0,Std1,Std2,Std3,Std4,Std5Std6

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Vero DNA Control定量参考品Std0即稀释为3 ng/μL的浓度,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std1,Std2,Std3,Std4,Std5,Std6离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

Std6

10 μL Std5 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试300 pg/μL~3 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-20℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中的Vero DNA标准品浓度(以制备加30 pg Vero DNAERC为例),具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL Std3,混匀标记为ERC

2回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加回收ERC纯化液。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2每管或孔中NTC样本20 μL Mix混合液(即15 μL Vero qPCR Mix + 5μL Vero Primer&Probe Mix+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

5. 反应体系

组分

体积(μL)

Vero qPCR Mix*

15

Vero Primer&Probe Mix

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

2 标准品反应体系

*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+4+1) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)× 3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

ERC (Extraction Recovery Control):待测样本中加入如10 μL3 pg/μL标准品DNA后进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

 

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

 

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

 

 

 

B

NTC

 

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

 

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

 

 

 

C

NTC

 

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

 

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

 

 

 

D

 

 

 

 

 

 

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

 

 

 

E

NCS

 

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

 

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

 

 

 

F

NCS

 

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

 

标准曲线Std6

标准曲线Std6

标准曲线Std6

 

 

 

G

NCS

 

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

 

 

 

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 上机参考板位

该示例是对Vero残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:6个浓度梯度的Vero DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2创建2个检测探针,Target 1命名为Vero-DNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“none”Target 2命名为“IC”,选择报告荧光基团为“CY5”,猝灭荧光基团为“none”。参比荧光为“ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”“30000”“3000”“300”“30”“3”(含义为每孔DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“300 pg/μL”“30 pg/μL”“3 pg/μL”“300 fg/μL”“30 fg/μL”“3 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”,参比荧光勾选“ROX”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60℃

30 sec

4 扩增程序

7. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率,加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.pg)×100%。

6阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35

8)待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1,如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大,则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本,则优先考虑样本加标回收率结果,IC结果作为参考。

 

Ver.CN20230517

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)

暂无内容

Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G) Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (2G)

暂无内容