Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)是一款采用公司新一代抗体法热启动Taq酶的荧光定量预混液。5× Mix预混合试剂包含反应缓冲液和酶mix,采用dUTP代替dTTP,并添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升多重qPCR反应扩增效率的因子,大大减少了非特异性PCR扩增和污染,能够保证引物效率的同时,进行多达四重的反应。本产品含有UDG酶,可有效防止气溶胶污染的风险。

 

组分信息

组分编号

组分名称

13891ES60

 (100 T)

13891ES80

(1000 T)

13891ES90

(5000 T)

13891ES92

(10000 T)

13891

5×TaqMan qPCR mix

500 μL

5 mL

25 mL

50 mL

 

储存条件

-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

1.反应体系

组分

体积 (μL)

终浓度

5×TaqMan qPCR mix

5

Primer mix (10 μM)

X

0.1-0.5 μM

Probe mix (10 μM)

X

50-250 nM

模板

1-10

ddH2O

up to 25

2.适用机型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex;

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Stratagene: MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.  

3.参考扩增程序

循环步骤

温度

时间

循环数

污染降解

37°C

5 min

1

预变性

97°C

30 s

1

变性

97°C

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)3 s

45

退火/延伸*

60°C

15 s

*退火/延伸温度可根据实验要求适当调整。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

Ver.CN20230526

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)

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Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)是一款采用公司新一代抗体法热启动Taq酶的荧光定量预混液。5× Mix预混合试剂包含反应缓冲液和酶mix,采用dUTP代替dTTP,并添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升多重qPCR反应扩增效率的因子,大大减少了非特异性PCR扩增和污染,能够保证引物效率的同时,进行多达四重的反应。本产品含有UDG酶,可有效防止气溶胶污染的风险。

 

组分信息

组分编号

组分名称

13891ES60

 (100 T)

13891ES80

(1000 T)

13891ES90

(5000 T)

13891ES92

(10000 T)

13891

5×TaqMan qPCR mix

500 μL

5 mL

25 mL

50 mL

 

储存条件

-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

1.反应体系

组分

体积 (μL)

终浓度

5×TaqMan qPCR mix

5

Primer mix (10 μM)

X

0.1-0.5 μM

Probe mix (10 μM)

X

50-250 nM

模板

1-10

ddH2O

up to 25

2.适用机型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex;

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Stratagene: MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.  

3.参考扩增程序

循环步骤

温度

时间

循环数

污染降解

37°C

5 min

1

预变性

97°C

30 s

1

变性

97°C

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)3 s

45

退火/延伸*

60°C

15 s

*退火/延伸温度可根据实验要求适当调整。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

Ver.CN20230526

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix(UDG plus)

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Gene Universal Taq-DNA聚合酶

 

Gene Universal位于美国特拉华州,是基因合成领域的。作为基因组学研究和应用生物技术的企业,基因环球拥有强大的技术力量。我们以的定制化服务和快捷的交货期,致力于提供更具成本效益的服务和产品,加速在药物发现、生物优化、食品和农业等领域的研究。
基因工程是基因工程、生物系统工程和合成生物学领域的专业。通过提供我们工业化、高强度的基因合成平台,利用*的技术,我们可以在短时间内同时传递正常和复杂的基因。我们还开发了复杂的软件程序来设计和优化复杂的基因库和基因系统。有了这些生物信息学工具和我们高效的生产管理,我们能够以高效、低成本、大规模的合成和组装基因和基因组dna来满足科研人员的需求。
同时,我们开发了多种重组蛋白平台。基于五种表达系统:细菌表达、哺乳动物表达(293&CHO)、酵母表达、昆虫表达和枯草芽孢杆菌表达系统,我们已成为您基因合成、蛋白质表达和抗体生产服务的一站式供应商。
我们的长期目标是成为dna合成和合成领域的,实现生命科学研究更高效、生物产业生产成本更低的繁荣前景。

 

Gene Universal Taq-DNA聚合酶
我公司生产的Taq-DNA聚合酶是采用基因改造技术生产的高保真DNA聚合酶,提高了PCR扩增效率和扩增特异性。扩增产物的3'端“A”碱基可直接克隆到T载体中。
优势
高保真度
功能强大,优化少
酶少,产量高
基因组DNA片段扩增(1Kb/min)

Using references

Product specification

Product Names Catalog Size Price
Taq DNA Polymerase PM07050 500U $25
PM07100 1000U $40
PM07200 2000U $75

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Bio-Serv动物模型饲料K9005 Universal Chain Assembly

上海金畔生物科技有限公司代理Bio-Serv模型动物饲料全线产品,欢迎访问官网了解更多产品信息。
Bio-Serv动物模型饲料K9005 Universal Chain Assembly

Product Details
  • Stainless Steel
  • Convenient way to suspend enrichment products
  • 13 3/4″ overall length
  • Cagewasher safe
  • Autoclavable
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Terra Universal 代理


Terra Universal 代理

简要描述:Terra Universal代理,Terra Universal上海代理,Terra Universal北京代理, Terra Universal代理, Terra Universal一级代理, Terra Universal代理
上海金畔生物科技有限公司 Terra Universal专业代理,具体产品信息欢迎电询:021-50837765

详细介绍

产品咨询

世界*实验材料供应商 Terra Universal上海金畔生物为其中国代理, Terra Universal在一直是行业的*,一直为广大科研客户提供zui为优质的产品和服务,上海金畔生物一直秉承为中国科研客户带来的产品,的服务, Terra Universal就是为了给广大科研客户带来更加完善的产品和服务,您的满意将是我们zui大的收获

 Terra Universal中国代理, Terra Universal上海代理, Terra Universal北京代理,Terra Universal广东代理, Terra Universal江苏代理Terra Universal湖北代理,Terra Universal天津,Terra Universal黑龙江代理,Terra Universal内蒙古代理,Terra Universal吉林代理,Terra Universal福建代理, Terra Universal江苏代理, Terra Universal浙江代理, Terra Universal四川代理,

 

Terra Universal is the leading manufacturing expert in critical environment applications, with over 35 years of design and fabrication experience in cleanroom-related industries. 

Terra Universal manufactures comprehensive lines of critical environment solutions, including modular cleanrooms, glove boxes, laminar flow benches and furniture designed to meet customer requirements for

Particle filtration 
Laminar flow control 
Temperature control 
Humidification/dehumidification 
Exhaust fume filtration 
Chemical vapor removal 
Ultra-clean materials 
Vibration isolation 
Biohazard containment 
Vacuum control 
Ergonomics 
Sterilization 
Static control 

Custom Manufacturer — Terra creates solutions for application-specific manufacturing challenges, quickly and economically. Terra’s manufacturing complex in Fullerton, California includes latest-technology CNC sheet metal and plastic equipment along with complete welding, electronics, and metal finishing shops. 

On-site Engineering and Technical Support — Terra’s engineering department works with you to design turnkey solutions. Systems are configured, assembled and tested before shipment. For many Terra systems, custom software configurations are available to meet user requirements for temperature, humidity, and decontamination cycles. 

Terra also maintains field technical support at locations throughout the U.S. and the world.

专注领域

Critical Environment Solutions, Cleanroom Construction & Installation, CNC Metal Fabrication, CNC Plastic Fabrication, Polypropylene Fabrication, Laminate Sealing, Electrical/Electronics Assembly, Cleanroom Cleaning and Packaging

 

公司  http://www.terrauniversal.com

 

 

上海金畔生物科技有限公司

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

该试剂盒可以将Illumina试剂盒构建的双链线性文库转化为兼容华大智造测序平台的环状ssDNA文库。构建的文库可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 进行测序。

 

产品组分

组分编号与名称

13342ES16

13342ES96

13342-A

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

AC-PCR Amplification mix

400 μL

2×1200 μL

13342-B

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

AC-PCR Primer mix

16 μL

96 μL

13342-C

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit  

App-A Splint Buffer

240 μL

2×720 μL

13342-D

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

Ligase

80 μL

480 μL

13342-E

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit 

Digestion Buffer

130 μL

780 μL

13342-F

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit 

Digestion Enzyme

32 μL

192 μL

 

运输与保存方法 

干冰运输。

所有组分-20°C保存,有效期1年。

*当运输条件、储存条件及使用方式都正确时,所有组分在有效期内均能保持完整活性。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途!

二、样本要求及处理

2.1样本要求

样本为线性dsDNA文库,接头序列符合下列之一:

index:

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

index:

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

线性dsDNA文库插入片段范围为 100 ~ 500 bp,同时主带集中在±100 bp 以内。

2.2 样本量要求

 根据文库总量选择合适的线性dsDNA投入量,详见表1:

1  线性dsDNA总量与浓度要求

线性dsDNA文库投入量(ng)

线性dsDNA文库总量(ng)

线性dsDNA文库浓度要求(ng/μl)

10

≤25

>0.45

25

25<文库总量<50

1<文库浓度<2.1

50

>50

>2.1

2.3 转换PCR

不同线性 dsDNA 文库投入量,所需 PCR 循环也不相同,详见表2:

2  不同线性dsDNA投入量PCR循环数推荐表

线性dsDNA文库投入量(ng)

推荐PCR循环数

10

8

25

7

50

6

2.4 转换文库pooling要求

1. 不推荐在转换PCR前对线性dsDNA进行pooling。

2. 需将接头转换 PCR 产物混合测序,则 Sample Barcode Pooling 应遵循碱基平衡的原则:最佳平衡状态 ATGC 4种碱基的占比应分别为 25% ,若不能达到 25%,则要保证每个 cycle 都存在 ATGC 四种碱基序列,并且最少的碱基不应低于 12.5%,最多的碱基不应高于 62.5%。

3. 不同片段长度的文库不建议 pooling 环化。

4. 若样本所需数据量相同且长度相同,则可以等量混合,每个样本所需的质量按照公式1进行计算:

公式1混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量 (ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量 (ng)/混合的样本个数 N

5. 混合后接头转换 PCR 产物总量为 1 pmol,总体积最多为 40 μL;若文库不足则用 TE buffer补充至 40 μL

三、关于磁珠纯化(Bead-based Clean Up)

1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检(Library Quality Analysis)

1. 转换文库推荐使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等双链 DNA 进行定量, 要求最终接头转换 PCR产物的摩尔产量至少为 1 pmol,可根据公式2计算或参考表2。

公式2 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

3  不同片段大小PCR产物1 pmol对应产量

PCR产物主片段大小(bp)

1 pmol对应产量(ng)

300

198

350

231

400

264

450

297

500

330

2. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  
3. 单链环状 DNA 产物纯化后产量应达到 60 fmol 以上方足够一次上机测序的量,可根据公式3计算或参考表3 。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
60 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

4  不同PCR产物片段大小对应60 fmol单链环产量

PCR产物主片段大小(bp)

60 fmol对应产量(ng)

300

5.94

350

6.93

400

7.92

450

8.91

500

9.90

 

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控:Cat#12640,dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642,1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效产品。

3. 单链环质控:Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效产品。

3. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

1  通用文库转换流程

三、操作步骤

Part A接头转换PCR

1.转换PCR

该步骤对线性dsDNA文库进行转换-转化为可以进行后续环化的线性dsDNA文库。

将表5中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。

5  转换PCR扩增反应体系

名称

体积(μL)

AC-PCR Amplification Mix

25

AC-PCR Primer Mix

1

线性dsDNA 文库

 

ddH2O

 

Total

50

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表6所示反应程序,进行PCR扩增。

6  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

参照注意事项中表2

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

2、转换PCR产物纯化

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads : DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:加入32 μL TE buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。

9. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移30 μL上清至干净的管中。

3、转换PCR产物质检

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等转换PCR产物进行定量,具体请参见注意事项四。

Part B 转换文库环化

1 变性

1. 根据文库长度,取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中,用 TE Buffer 补充至总体积 40 μL。

4. 混匀后,在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min,之后立即置于冰上,冰浴 2 min 后瞬时离心。

2 单链环化

1. 将表7中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表7反应体系。

7  单链环化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

40

App-A Splint Buffer

15

Ligase

5

Total

60

3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表8所示摄制反应程序,进行单链环化反应。

8  单链环化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

15 min

4°C

Hold

3 酶切消化

1. 将表9中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表9所示反应体系。

9 酶切消化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

60

Digestion Buffer

8

Digestion Enzyme

2

Total

70

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表10的条件进行反应:

10  酶切消化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

10 min

4°C

Hold

5. 反应结束后,瞬时离心,立即进行纯化。

4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中,室温孵育10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约2 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入22 μL TE Buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置10 min。

9. 短暂离心,将 PCR 管始终置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约 2min),将上清小心移至新 PCR 管中, -20℃保存,待制备 DNB。

5 消化产物质控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量,具体请参见注意事项四。

 

HB220117

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

暂无内容

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该试剂盒可以将Illumina试剂盒构建的双链线性文库转化为兼容华大智造测序平台的环状ssDNA文库。构建的文库可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 进行测序。

 

产品组分

组分编号与名称

13342ES16

13342ES96

13342-A

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

AC-PCR Amplification mix

400 μL

2×1200 μL

13342-B

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

AC-PCR Primer mix

16 μL

96 μL

13342-C

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit  

App-A Splint Buffer

240 μL

2×720 μL

13342-D

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

Ligase

80 μL

480 μL

13342-E

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit 

Digestion Buffer

130 μL

780 μL

13342-F

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit 

Digestion Enzyme

32 μL

192 μL

 

运输与保存方法 

干冰运输。

所有组分-20°C保存,有效期1年。

*当运输条件、储存条件及使用方式都正确时,所有组分在有效期内均能保持完整活性。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途!

二、样本要求及处理

2.1样本要求

样本为线性dsDNA文库,接头序列符合下列之一:

index:

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

index:

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

线性dsDNA文库插入片段范围为 100 ~ 500 bp,同时主带集中在±100 bp 以内。

2.2 样本量要求

 根据文库总量选择合适的线性dsDNA投入量,详见表1:

1  线性dsDNA总量与浓度要求

线性dsDNA文库投入量(ng)

线性dsDNA文库总量(ng)

线性dsDNA文库浓度要求(ng/μl)

10

≤25

>0.45

25

25<文库总量<50

1<文库浓度<2.1

50

>50

>2.1

2.3 转换PCR

不同线性 dsDNA 文库投入量,所需 PCR 循环也不相同,详见表2:

2  不同线性dsDNA投入量PCR循环数推荐表

线性dsDNA文库投入量(ng)

推荐PCR循环数

10

8

25

7

50

6

2.4 转换文库pooling要求

1. 不推荐在转换PCR前对线性dsDNA进行pooling。

2. 需将接头转换 PCR 产物混合测序,则 Sample Barcode Pooling 应遵循碱基平衡的原则:最佳平衡状态 ATGC 4种碱基的占比应分别为 25% ,若不能达到 25%,则要保证每个 cycle 都存在 ATGC 四种碱基序列,并且最少的碱基不应低于 12.5%,最多的碱基不应高于 62.5%。

3. 不同片段长度的文库不建议 pooling 环化。

4. 若样本所需数据量相同且长度相同,则可以等量混合,每个样本所需的质量按照公式1进行计算:

公式1混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量 (ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量 (ng)/混合的样本个数 N

5. 混合后接头转换 PCR 产物总量为 1 pmol,总体积最多为 40 μL;若文库不足则用 TE buffer补充至 40 μL

三、关于磁珠纯化(Bead-based Clean Up)

1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检(Library Quality Analysis)

1. 转换文库推荐使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等双链 DNA 进行定量, 要求最终接头转换 PCR产物的摩尔产量至少为 1 pmol,可根据公式2计算或参考表2。

公式2 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

3  不同片段大小PCR产物1 pmol对应产量

PCR产物主片段大小(bp)

1 pmol对应产量(ng)

300

198

350

231

400

264

450

297

500

330

2. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  
3. 单链环状 DNA 产物纯化后产量应达到 60 fmol 以上方足够一次上机测序的量,可根据公式3计算或参考表3 。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
60 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

4  不同PCR产物片段大小对应60 fmol单链环产量

PCR产物主片段大小(bp)

60 fmol对应产量(ng)

300

5.94

350

6.93

400

7.92

450

8.91

500

9.90

 

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控:Cat#12640,dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642,1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效产品。

3. 单链环质控:Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效产品。

3. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程

NGS文库转换试剂盒|Universal Library Convert Kit

1  通用文库转换流程

三、操作步骤

Part A接头转换PCR

1.转换PCR

该步骤对线性dsDNA文库进行转换-转化为可以进行后续环化的线性dsDNA文库。

将表5中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。

5  转换PCR扩增反应体系

名称

体积(μL)

AC-PCR Amplification Mix

25

AC-PCR Primer Mix

1

线性dsDNA 文库

 

ddH2O

 

Total

50

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表6所示反应程序,进行PCR扩增。

6  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

参照注意事项中表2

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

2、转换PCR产物纯化

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads : DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:加入32 μL TE buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。

9. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移30 μL上清至干净的管中。

3、转换PCR产物质检

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等转换PCR产物进行定量,具体请参见注意事项四。

Part B 转换文库环化

1 变性

1. 根据文库长度,取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中,用 TE Buffer 补充至总体积 40 μL。

4. 混匀后,在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min,之后立即置于冰上,冰浴 2 min 后瞬时离心。

2 单链环化

1. 将表7中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表7反应体系。

7  单链环化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

40

App-A Splint Buffer

15

Ligase

5

Total

60

3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表8所示摄制反应程序,进行单链环化反应。

8  单链环化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

15 min

4°C

Hold

3 酶切消化

1. 将表9中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表9所示反应体系。

9 酶切消化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

60

Digestion Buffer

8

Digestion Enzyme

2

Total

70

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表10的条件进行反应:

10  酶切消化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

10 min

4°C

Hold

5. 反应结束后,瞬时离心,立即进行纯化。

4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中,室温孵育10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约2 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入22 μL TE Buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置10 min。

9. 短暂离心,将 PCR 管始终置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约 2min),将上清小心移至新 PCR 管中, -20℃保存,待制备 DNB。

5 消化产物质控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量,具体请参见注意事项四。

 

HB220117

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