FailSafe™ PCR系统

一个可信赖的持续扩增常规及非常规模板的新系统

Haiying Grunenwald, EPICENTRE Technologies
 

介绍：
    成功的PCR依赖于包括模板质量，所选酶，设计的引物以及所采用的扩增条件在内的多重因素。一个理想的PCR系统应当能够：

（1）扩增包括难扩增（如高GC含量或二级结构）及长序列在内的各种类型模板

（2）高保真扩增

（3）简便易行，进行扩增时无需优化条件

    然而目前还没有一个PCR系统能同时满足这些要求。在此，我们介绍FailSafe PCR系统，它可以确保成功及持续地扩增常规及非常规模板，包括长序模板（长至20kb）和高GC含量模板（GC含量>80%）。 由于普通Taq酶的扩增能力很强，但是错配率高，在出现错配时酶会脱离模版而导致Taq酶通常只能扩较小的片段（<3kb）；常规的高保真酶如Pfu、Vent带校正功能而扩增能力较弱，本系统综合二者的优点：FailSafe PCR酶混合物是含有一个3’–5’高保真校读酶的Taq酶混合物，可以高保真地扩增长片段的PCR产物，产物可以直接克隆入TA或平端载体；另一个成分是一套FailSafe PCR PreMixes，它由缓冲液，dNTPs，各种含量的MgCl₂以及FailSafe PCR增强剂（含甜菜碱）组成。使用者只需简单地将模板，引物，FailSafe PCR酶混合物加入FailSafe PCR PreMixes即可进行扩增。无需繁琐地进行条件优化，PreMixes中的FailSafe PCR增强剂可以增加PCR反应的特异性，敏感性及持续性。

    本文中，我们比较了FailSafe PCR系统与其它商品化的PCR酶及酶混合物的扩增保真度，还证明了利用FailSafe PCR系统可以扩增长序，难扩增序列模板以及进行多重PCR。

材料与方法：
1. FailSafe PCR酶混合物的保真度
    克隆，表达，突变分析和长程PCR要求使用低错配率的酶。使用以PCR为基础的正向突变分析，我们比较了FailSafe PCR酶混合物与其它供应商的酶及酶混合物的扩增保真度。该方法类似Cline等人的方法1，通过扩增lacZ基因的a-互补区，使用蓝/白克隆筛选分析评估序列的完整性。扩增反应使用的试剂及方法依相应厂商提供的进行，之后逐次进行高保真度分析。结果表明FailSafe PCR酶混合物的保真度至少是标准Taq聚和酶的三倍，与被测的其它高保真酶混合物相当或更好。尽管有报道认为FailSafe PCR酶混合物的保真度稍逊pfu DNA聚和酶，但FailSafe PCR系统要强健得多，可以从难扩增模板（如高GC含量）和长序模板获得更特异和持续的扩增，而在这方面pfu DNA聚和酶是欠缺的。

2. 使用FailSafe PCR系统扩增长序列
    扩增长链模板经常需要进行繁琐的反应条件优化（包括累加PCR），为了证明FailSafe PCR系统无需优化各反应因素即可扩增长链及标准模板，我们从l嗜菌体，人及大肠杆菌基因组上扩增长度从5kb到21.5kb的片段。

    对于每个模板/引物对结合物，使用FailSafe PCR PreMixes进行PCR反应。每50ml反应体系中含1-500ng的基因组DNA（由模板决定），10-50pmol的各引物（由模板决定），2.5U的FailSafe PCR酶混合物以及25ml的FailSafe PCR 2´PreMix（A-L）。嗜菌体模板扩增反应如下：94°C变性1min，98°C，20sec；56°C，1min（扩增5kb和10kb）/68°C，5min（扩增5kb）/10min（扩增10kb）或20min（扩增20kb），共计20个循环。扩增大肠杆菌基因组按以下程序进行：94°C变性1min后，扩增6kb模板进行30个循环，其它进行20个循环的98°C，20sec；68°C，5min（6kb）或10min（10kb）或20min（18kb）。扩增人基因组DNA程序：94°C，1min，98°C，20sec；68°C，20min共14个循环，zui后是10个延伸时间增加15sec的循环。结果表明扩增出的所有PCR产物产量高，特异性好。

3. 使用FailSafe PCR系统扩增GC富集模板
    如同PCR扩增长序列，扩增那些含大量GC或二级结构的难扩增模板经常需要进行条件优化。为了证明使用FailSafe PCR系统可以不需优化条件而进行GC富集的模板的扩增，我们扩增了人FMR1基因的250-350bp长短的区域（GC含量为80-85%）2。该基因CGG重复区的扩大与脆性X染色体综合症相关。使用Epicentre的MasterPureä DNA纯化试剂盒从血液中纯化出人基因组DNA后，利用FailSafe PCR PreMixes进行PCR反应。每50ml反应体系中含100ng的基因组DNA，50pmol的各引物，1.25U的FailSafe PCR酶混合物和25ml的FailSafe PCR 2´PreMix（A-L）。94°C变性2min后，加入酶混合物，扩增反应按以下程序进行：94°C，4min，30个98°C，30sec；65°C，1min；72°C，1min循环。用一套12个反应，证明FailSafe PCR PreMix J扩增FMR1脆性X基因的富含GC区*。

    对四个独立样本，使用FailSafe PCR PreMix J和FailSafe PCR酶混合物进行脆性X基因该区域的扩增。结果表明FailSafe PCR系统可以持续扩增含80-85%GC的区域。由于各样品的CGG重复数不同，PCR产物的大小稍有不同，长度从250bp到350bp。

4. 使用FailSafe PCR系统进行多重扩增
    FailSafe PCR系统被检测进行多重扩增的能力。使用FailSafe PCR PreMixes扩增囊性纤维化跨膜传导调节蛋白基因的五个外显子3。每50ml多重扩增PCR反应体系中含500ng的基因组DNA，25pmol的各引物2，2.5U的FailSafe PCR酶混合物和25ml的FailSafe PCR 2´PreMix。94°C变性2min后，加入酶混合物，进行扩增反应：30个94°C，10sec；53°C，10sec；74°C，10sec循环，zui后74°C延伸5min。

    CFTR基因的外显子4，10，11，20和21的PCR扩增产物分别为423，340，233，289和396bp2，结果表明使用FailSafe PCR PreMix C获得*扩增。多重分析产生每个外显子正确大小的产物。使用FailSafe PCR系统进行一套反应可成功地获得扩增自CFTR基因的5条PCR产物。

总结：
    FailSafe PCR系统确保从各种模板（包括至少20kb长度的长序模板，富含GC的模板及多重PCR）成功地进行PCR。FailSafe PCR酶混合物的高保真性对于PCR产物进行克隆，表达及突变分析重要。该试剂盒方便地确保从任何模板进行简单的一步扩增，而无需进行繁琐的条件优化，也不需对不同模板修改方法。这些优点使得FailSafe PCR系统适于进行常规及非常规的PCR扩增。

参考文献：
1. Cline, J. et al. （1996） Nucl. Acids Res. 24（18）, 3546.
2. Fu, Y. H. et al. （1991） Cell 67（6）, 1047.
3. Richards, B. et al. （1993） Human Molecular Genetics 2（2）, 159.