siRNA/miRNA体外转染试剂|Hieff Trans<sup>®</sup> in vitro siRNA/miRNA Transfection Reagent
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产品描述
Hieff Trans® siRNA/miRNA体外转染试剂是一种非脂质体PEI阳离子、两性分子转染试剂，为siRNA转染到哺乳动物细胞中而开发。适用于siRNA和miRNA的转染。这种转染试剂包裹siRNA或miRNA形成阳离子复合物，该复合物与细胞表面带负电的蛋白聚糖相互作用吸附在细胞表面，通过内吞进入细胞，形成内含体。该转染试剂具有质子海绵的作用，能够吸收溶酶体中的H+，质子的不断流入，导致复合体肿胀破裂，从而使外源siRNA或miRNA释放到细胞质中。
该产品可在广泛的细胞系中，实现1 nM的siRNA超过90%的表达效率，避免了脱靶效应。适用于多种细胞转染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等贴壁细胞；以及难以转染的悬浮细胞系，如K562或THP-1细胞，可达到80%的沉默效率；同时还包括一些原代细胞，原代人成纤维细胞和原代人肝细胞等，可达到80%的沉默效率。
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。产品2-8 ℃保存，一年有效。不可冷冻！
注意事项
1）整个实验过程使用无RNA酶和无热原性的材料，如离心管、枪头、缓冲液。
2）转染前，确保siRNA是经过PAGE纯化和脱盐处理过的，高纯度的siRNA或者miRNA有助于获得较高的转染效率。
3）PEI阳离子转染试剂应该在2-8 ℃保存，要注意避免多次反复长时间开盖，否则可能会导致PEI挥发，降低转染效率。
4）转染前一天，确保接种贴壁细胞密度在30%-50%左右，对于一些小细胞和生长缓慢的细胞，接种密度可适当扩大2倍。
5）转染前，确保siRNA/miRNA基因沉默表达不会影响细胞活力。
6）该产品只适合体外转染，不能用于体内转染。
7）本产品仅作科研用途！
操作流程
一．贴壁细胞转染（以24孔板和转染1 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表1）
接种贴壁细胞
1.为了提高转染效率，建议在转染前一天接种细胞，接种细胞密度建议30%-50%左右，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。
2.按照以下体系配制siRNA-PEI或miRNAPEI子核酸转染试剂阳离复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释8.4 ng siRNA (0.6 pmoles)，混匀。
2）立刻向100 μL的siRNA中加入2 μL的转染试剂，旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30min
4）在形成复合物过程中，移除细胞生长培养基，每孔中加入500 μL新鲜预热的完全培养基。
5）直接将100 µL siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物加入细胞中，摇动培养板，轻轻混匀。最终体积为600 µL ，siRNA终浓度为1 nM。
6）37 ℃，5% CO2培养箱培养，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24–72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
图1 转染贴壁细胞操作流程
【注】：由于靶基因、细胞类型、siRNA效价、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周转率等因素，均会影响siRNA的转染效率。建议选取siRNA浓度在1 nM到10 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表1。
表1 siRNA终浓度为1 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值
|
培养皿 |
siRNA物质的量(pmoles) |
每孔siRNA的含量（ng） |
siRNA转染试剂体积（µL） |
形成PEI-siRNA复合物的体积（µL） |
完全培养基的体积（含血清+双抗） |
加入复合物后，细胞培养基总体积 |
|
96孔板 |
0.17 |
2.4 |
0.7-0.8 |
50 |
125 µL |
175 µL |
|
24孔板 |
0.6 |
8.6 |
1-3 |
100 |
500 µL |
600 µL |
|
12孔板 |
1.2 |
17 |
2-6 |
200 |
1 mL |
1.2 mL |
|
6孔板 |
2.2 |
31 |
4-12 |
200 |
2 mL |
2.2 mL |
|
25cm2培养瓶 |
4.4 |
62 |
10-20 |
400 |
4 mL |
4.4 mL |
|
75cm2培养瓶 |
10.5 |
147 |
30-50 |
500 |
10 mL |
10.5 mL |
表2 siRNA终浓度为10 – 50 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值
|
培养皿 |
siRNA转染试剂体积（µL） |
形成复合物的体积（无血清培养基）（µL） |
完全培养基的体积（含血清+双抗） |
加入复合物后，细胞总体积 |
|
96孔板 |
0.5-1.5 |
50 |
125 µL |
175 µL |
|
24孔板 |
2-4 |
100 |
500 µL |
600 µL |
|
12孔板 |
4-8 |
200 |
1 mL |
1.2 mL |
|
6孔板 |
8-16 |
200 |
2 mL |
2.2 mL |
|
25cm2培养瓶 |
15-25 |
400 |
4 mL |
4.4 mL |
二．悬浮细胞转染（以24孔板和转染5 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表4）
接种细胞
1.为了优化悬浮细胞转染条件，与贴壁细胞相比，需要降低悬浮细胞培养基的体积。根据培养皿大小和完整培养基的体积，推荐接种悬浮细胞的数量如下表3所示。
表3 转染当天，根据培养皿的大小，接种悬浮细胞数量参考值
|
培养皿 |
底面积(cm2) |
每孔接种细胞悬浮液体积（μL） |
转染当天接种细胞数 |
|
384孔板 |
0.1 |
25 |
5 ×103~1×104 |
|
96孔板 |
0.32 |
50 |
1×104~ ×104 |
|
24孔板 |
2 |
200 |
1×105 ~ 2×105 |
|
12孔板 |
4.5 |
500 |
2×105 ~ 4×105 |
|
6孔板 |
9.6 |
1000 |
5×105 ~ 2×106 |
|
25cm2培养瓶 |
25-28 |
2000 |
2×106~ 5×106 |
2.按照以下体系配制siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释21 ng siRNA (1.5 pmols)，混匀。
2）向100 μL的siRNA中加入4 μL的转染试剂，立刻旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温孵育15 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30 min
4）在每孔200 μL细胞悬浮液中，加入100 μL的siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物，轻轻混匀。最终体积为300 µL，siRNA终浓度为5 nM。
5）37 ℃，5% CO2培养箱培养4-6 h后，再加入700 µL完全培养基，轻轻摇动培养板使其混匀。
6）继续放入培养箱中孵育，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24–72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
【注】：为了优化内源性基因沉默，建议选取siRNA浓度在5 nM到20 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表4。
表4 siRNA浓度为5 nM时，在悬浮细胞中的参考值
|
培养皿 |
siRNA的浓度(pmoles) |
每孔siRNA的含量（ng） |
转染试剂体积（µL） |
形成复合物培养基体积（µL） |
悬浮细胞的体积 |
转染4-6h后另加入培养基的体积 |
|
384孔板 |
0.25 |
3.75 |
1 ± 0.5 |
25 |
25 µL |
0 µL |
|
96孔板 |
0.5 |
7.5 |
2 ± 1 |
50 |
50 µL |
100 µL |
|
24孔板 |
1.5 |
21 |
3 ± 2 |
100 |
200 µL |
700 µL |
|
12孔板 |
3.5 |
49 |
6 ± 4 |
200 |
500 µL |
1 mL |
|
6孔板 |
6 |
84 |
10 ± 8 |
200 |
1 mL |
2 mL |
|
25cm2培养瓶 |
12 |
168 |
15 ±10 |
400 |
2 mL |
4 mL |
表5 悬浮细胞中siRNA浓度、转染试剂的用量参考值
|
培养皿 |
siRNA的终浓度/孔（nM） |
转染试剂的体积/孔（µL） |
|
96孔板 |
1 ~ 20 |
1 ± 0.5 |
|
24孔板 |
2 ± 1 |
|
|
12孔板 |
3 ± 2 |
|
|
6孔板 |
10 ± 8 |
|
|
96孔板 |
20 ~ 50 |
1.5 ± 0.5 |
|
24孔板 |
3 ± 1 |
|
|
12孔板 |
5 ± 2 |
|
|
6孔板 |
15 ± 8 |
三．miRNA转染操作流程
该转染试剂也适合转染miRNA，转染贴壁细胞和悬浮细胞的具体操作请参考siRNA的操作流程。
HB220930
产品描述
Hieff Trans® siRNA/miRNA体外转染试剂是一种非脂质体PEI阳离子、两性分子转染试剂，为siRNA转染到哺乳动物细胞中而开发。适用于siRNA和miRNA的转染。这种转染试剂包裹siRNA或miRNA形成阳离子复合物，该复合物与细胞表面带负电的蛋白聚糖相互作用吸附在细胞表面，通过内吞进入细胞，形成内含体。该转染试剂具有质子海绵的作用，能够吸收溶酶体中的H+，质子的不断流入，导致复合体肿胀破裂，从而使外源siRNA或miRNA释放到细胞质中。
该产品可在广泛的细胞系中，实现1 nM的siRNA超过90%的表达效率，避免了脱靶效应。适用于多种细胞转染，包括Hela、MCF-7、HepG2、CHO等贴壁细胞；以及难以转染的悬浮细胞系，如K562或THP-1细胞，可达到80%的沉默效率；同时还包括一些原代细胞，原代人成纤维细胞和原代人肝细胞等，可达到80%的沉默效率。
运输与保存方法
冰袋（wet ice）运输。产品2-8 ℃保存，一年有效。不可冷冻！
注意事项
1）整个实验过程使用无RNA酶和无热原性的材料，如离心管、枪头、缓冲液。
2）转染前，确保siRNA是经过PAGE纯化和脱盐处理过的，高纯度的siRNA或者miRNA有助于获得较高的转染效率。
3）PEI阳离子转染试剂应该在2-8 ℃保存，要注意避免多次反复长时间开盖，否则可能会导致PEI挥发，降低转染效率。
4）转染前一天，确保接种贴壁细胞密度在30%-50%左右，对于一些小细胞和生长缓慢的细胞，接种密度可适当扩大2倍。
5）转染前，确保siRNA/miRNA基因沉默表达不会影响细胞活力。
6）该产品只适合体外转染，不能用于体内转染。
7）本产品仅作科研用途！
操作流程
一．贴壁细胞转染（以24孔板和转染1 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表1）
接种贴壁细胞
1.为了提高转染效率，建议在转染前一天接种细胞，接种细胞密度建议30%-50%左右，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。
2.按照以下体系配制siRNA-PEI或miRNAPEI子核酸转染试剂阳离复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释8.4 ng siRNA (0.6 pmoles)，混匀。
2）立刻向100 μL的siRNA中加入2 μL的转染试剂，旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温下孵育10 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30min
4）在形成复合物过程中，移除细胞生长培养基，每孔中加入500 μL新鲜预热的完全培养基。
5）直接将100 µL siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物加入细胞中，摇动培养板，轻轻混匀。最终体积为600 µL ，siRNA终浓度为1 nM。
6）37 ℃，5% CO2培养箱培养，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24–72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
图1 转染贴壁细胞操作流程
【注】：由于靶基因、细胞类型、siRNA效价、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周转率等因素，均会影响siRNA的转染效率。建议选取siRNA浓度在1 nM到10 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表1。
表1 siRNA终浓度为1 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值
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培养皿 |
siRNA物质的量(pmoles) |
每孔siRNA的含量（ng） |
siRNA转染试剂体积（µL） |
形成PEI-siRNA复合物的体积（µL） |
完全培养基的体积（含血清+双抗） |
加入复合物后，细胞培养基总体积 |
|
96孔板 |
0.17 |
2.4 |
0.7-0.8 |
50 |
125 µL |
175 µL |
|
24孔板 |
0.6 |
8.6 |
1-3 |
100 |
500 µL |
600 µL |
|
12孔板 |
1.2 |
17 |
2-6 |
200 |
1 mL |
1.2 mL |
|
6孔板 |
2.2 |
31 |
4-12 |
200 |
2 mL |
2.2 mL |
|
25cm2培养瓶 |
4.4 |
62 |
10-20 |
400 |
4 mL |
4.4 mL |
|
75cm2培养瓶 |
10.5 |
147 |
30-50 |
500 |
10 mL |
10.5 mL |
表2 siRNA终浓度为10 – 50 nM时，转染试剂、培养基的用量参考值
|
培养皿 |
siRNA转染试剂体积（µL） |
形成复合物的体积（无血清培养基）（µL） |
完全培养基的体积（含血清+双抗） |
加入复合物后，细胞总体积 |
|
96孔板 |
0.5-1.5 |
50 |
125 µL |
175 µL |
|
24孔板 |
2-4 |
100 |
500 µL |
600 µL |
|
12孔板 |
4-8 |
200 |
1 mL |
1.2 mL |
|
6孔板 |
8-16 |
200 |
2 mL |
2.2 mL |
|
25cm2培养瓶 |
15-25 |
400 |
4 mL |
4.4 mL |
二．悬浮细胞转染（以24孔板和转染5 nM siRNA为例，其他培养板加样体积请参考表4）
接种细胞
1.为了优化悬浮细胞转染条件，与贴壁细胞相比，需要降低悬浮细胞培养基的体积。根据培养皿大小和完整培养基的体积，推荐接种悬浮细胞的数量如下表3所示。
表3 转染当天，根据培养皿的大小，接种悬浮细胞数量参考值
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培养皿 |
底面积(cm2) |
每孔接种细胞悬浮液体积（μL） |
转染当天接种细胞数 |
|
384孔板 |
0.1 |
25 |
5 ×103~1×104 |
|
96孔板 |
0.32 |
50 |
1×104~ ×104 |
|
24孔板 |
2 |
200 |
1×105 ~ 2×105 |
|
12孔板 |
4.5 |
500 |
2×105 ~ 4×105 |
|
6孔板 |
9.6 |
1000 |
5×105 ~ 2×106 |
|
25cm2培养瓶 |
25-28 |
2000 |
2×106~ 5×106 |
2.按照以下体系配制siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物：
1）对于每孔细胞，使用100 μL无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释21 ng siRNA (1.5 pmols)，混匀。
2）向100 μL的siRNA中加入4 μL的转染试剂，立刻旋涡10秒，充分混匀。
3）在室温孵育15 min，使得形成siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物。
【注】：孵育时间不要超过30 min
4）在每孔200 μL细胞悬浮液中，加入100 μL的siRNA-PEI阳离子核酸转染试剂复合物，轻轻混匀。最终体积为300 µL，siRNA终浓度为5 nM。
5）37 ℃，5% CO2培养箱培养4-6 h后，再加入700 µL完全培养基，轻轻摇动培养板使其混匀。
6）继续放入培养箱中孵育，直至目的基因表达。建议一般mRNA表达水平通常在24–72 h，蛋白表达水平在48-96 h。
【注】：为了优化内源性基因沉默，建议选取siRNA浓度在5 nM到20 nM之间。转染试剂的体积应根据siRNA浓度和培养皿的大小进行调整，请参见下表4。
表4 siRNA浓度为5 nM时，在悬浮细胞中的参考值
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培养皿 |
siRNA的浓度(pmoles) |
每孔siRNA的含量（ng） |
转染试剂体积（µL） |
形成复合物培养基体积（µL） |
悬浮细胞的体积 |
转染4-6h后另加入培养基的体积 |
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384孔板 |
0.25 |
3.75 |
1 ± 0.5 |
25 |
25 µL |
0 µL |
|
96孔板 |
0.5 |
7.5 |
2 ± 1 |
50 |
50 µL |
100 µL |
|
24孔板 |
1.5 |
21 |
3 ± 2 |
100 |
200 µL |
700 µL |
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12孔板 |
3.5 |
49 |
6 ± 4 |
200 |
500 µL |
1 mL |
|
6孔板 |
6 |
84 |
10 ± 8 |
200 |
1 mL |
2 mL |
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25cm2培养瓶 |
12 |
168 |
15 ±10 |
400 |
2 mL |
4 mL |
表5 悬浮细胞中siRNA浓度、转染试剂的用量参考值
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培养皿 |
siRNA的终浓度/孔（nM） |
转染试剂的体积/孔（µL） |
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96孔板 |
1 ~ 20 |
1 ± 0.5 |
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24孔板 |
2 ± 1 |
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12孔板 |
3 ± 2 |
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6孔板 |
10 ± 8 |
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96孔板 |
20 ~ 50 |
1.5 ± 0.5 |
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24孔板 |
3 ± 1 |
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12孔板 |
5 ± 2 |
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6孔板 |
15 ± 8 |
三．miRNA转染操作流程
该转染试剂也适合转染miRNA，转染贴壁细胞和悬浮细胞的具体操作请参考siRNA的操作流程。
HB220930
Q：绿光标记的siRNA，转染5h后观察，只有一些杂点，没有细胞形态什么原因？
A：转染进去的 整个细胞是绿色的，可以清晰的看到细胞形态，没有转染进去的就是绿色的杂点儿。
Q：转染后可以换液吗？
A：可以换液，转然后8h换液，建议不换液，转染试剂毒性很小，不换液转染效率可以提高。
[1] Zhang Y, Hu R, Xi B, Nie D, Xu H, Liu A. Mechanisms of Senescence-Related NKG2D Ligands Release and Immune Escape Induced by Chemotherapy in Neuroblastoma Cells. Front Cell Dev Biol. 2022;10:829404. Published 2022 Mar 2. doi:10.3389/fcell.2022.829404(IF:6.684)
[2] Cui B, Wang Y, Jin J, et al. Resveratrol Treats UVB-Induced Photoaging by Anti-MMP Expression, through Anti-Inflammatory, Antioxidant, and Antiapoptotic Properties, and Treats Photoaging by Upregulating VEGF-B Expression. Oxid Med Cell Longev. 2022;2022:6037303. Published 2022 Jan 4. doi:10.1155/2022/6037303(IF:6.543)
[3] Liu Y, Zeng Y, Si HB, Tang L, Xie HQ, Shen B. Exosomes Derived From Human Urine-Derived Stem Cells Overexpressing miR-140-5p Alleviate Knee Osteoarthritis Through Downregulation of VEGFA in a Rat Model. Am J Sports Med. 2022;50(4):1088-1105. doi:10.1177/03635465221073991(IF:6.203)
[4] Zhang ZD, Wen B, Li DJ, et al. AKT serine/threonine kinase 2-mediated phosphorylation of fascin threonine 403 regulates esophageal cancer progression. Int J Biochem Cell Biol. 2022;145:106188. doi:10.1016/j.biocel.2022.106188(IF:5.085)
[5] Tan S, Zhou Y, Zhao H, et al. Comprehensive transcriptome analysis of hypothalamus reveals genes associated with disorders of sex development in pigs. J Steroid Biochem Mol Biol. 2021;210:105875. doi:10.1016/j.jsbmb.2021.105875(IF:4.294)
[6] Niu M, Yi M, Dong B, Luo S, Wu K. Upregulation of STAT1-CCL5 axis is a biomarker of colon cancer and promotes the proliferation of colon cancer cells. Ann Transl Med. 2020;8(15):951. doi:10.21037/atm-20-4428(IF:3.297)