Hifair® V Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR Kit是以RNA为模板进行多重定量PCR反应的试剂盒。在实验的过程中，逆转录和定量PCR在同一反应管中进行，简化了实验操作，降低了污染的风险。独特的Buffer设计，在体系中不包含影响冻干工艺的化学试剂，可用于一步法RT-qPCR冻干反应体系的配制和产品设计。

本试剂盒利用耐热Hifair® V Reverse Transcriptase高效合成第一链cDNA，并利用UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase进行定量扩增。本试剂盒主要包含优化的冻干Buffer，Enzymes Mix等，缓冲液中已含有Mg²⁺和dNTP等，并添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升多重qPCR反应扩增效率的因子，能够在保证引物扩增效率的同时，进行多重荧光定量扩增反应。

产品组分

【注】1) 4×Hifair® V Lyo-Buffer为Lyo-nCoV Multiplex One Step RT-qPCR Probe Buffer的简写。

 2) Hifair® V Lyo-Enzyme Mix主要包含有耐热Hifair® V Reverse Transcriptase和UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase。

适用机型

ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™，ABI 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex，Stratagene MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™，Bio-Rad CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ™5, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon® 2, Chromo4™，Eppendorf Mastercycler® ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene® Q, Rotor-Gene® 3000, Rotor-Gene® 6000，Roche Applied Science LightCycler® 480, LightCycler® 2.0; Lightcycler® 96，Thermo Scientific PikoReal Cycler; Cepheid SmartCycler®; Illumina Eco qPCR

运输与保存方式

冰袋运输。

4×Hifair® V Lyo-Buffer -20℃保存，有效期1年，Hifair® V Lyo-Enzyme Mix 4℃保存。有效期6个月。

本品避免反复冻融。建议分装保存。

注意事项

1. 实验过程中请使用RNase free耗材。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 本产品仅作科研用途！

反应体系（以25 μL为例）

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：Primer Mix中包含多对引物，通常每条引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM间进行调整。

b) 探针浓度：Probe Mix中包含多条不同荧光信号的探针，每条探针的浓度可根据具体情况在50-300 nM间调整。

c) 模板稀释：qPCR灵敏度极高，建议将模板进行稀释使用，控制Ct值在20-35之间适宜。

d) 反应体系：推荐使用25 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

标准扩增程序
 

【注】                                                                                             

a) 逆转录：42℃或者50℃均可，时间 10-15 min。

b) 扩增反应：扩增反应温度根据设计的引物Tm值进行调整。CDC官方推荐的ORF1ab和N引物，退火温度建议≥60℃。

c) 荧光信号采集：不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。

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Hieff Unicon^® Lyo Multiplex One Step RT-qPCR Kit是以RNA为模板进行多重定量PCR反应的试剂盒，已经添加了冻干保护剂，可用于冻干。

产品组分

【注】10×Hifair^® V Lyo-Enzyme Mix主要包含有耐热Hifair^® V Reverse Transcriptase和UNICON^® HotStart Taq DNA Polymerase。

运输与保存方式

1.运输方式：冰袋运输。

2.保存方式：Part 1：13667-A【4×Hifair^® V Lyo-Buffer】-20℃保存，有效期1年。

13667-D【冻干保护剂】-20℃保存，有效期1年。

Part 2：13667-B【MgCl₂（25 mM）】 4℃保存，有效期3年。

13667-C【10×Hifair^® V Lyo-Enzyme Mix】4℃保存，有效期6个月。

3.本品避免反复冻融。建议分装保存。

反应体系

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：Primer Mix中包含多对引物，通常每条引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM间进行调整。

b) 探针浓度：Probe Mix中包含多条不同荧光信号的探针，每条探针的浓度可根据具体情况在50-300 nM间调整。

c) 模板稀释：qPCR灵敏度极高，建议将模板进行稀释使用，控制Ct值在20-35之间适宜。

d) 反应体系：推荐使用25 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

参考扩增程序

【注】                                                          
a) 逆转录：42℃或者50℃均可，时间 10-15 min。
b) 扩增反应：扩增反应温度根据设计的引物Tm值进行调整。CDC官方推荐的ORF1ab和N引物，退火温度建议≥60℃。
c) 荧光信号采集：不同的qPCR检测仪器所需的荧光信号采集时间不同，请根据最短时间限制进行设置。

注意事项

1.辅料配方发生微量的变化，需重新测定冻干参数，并做相应调整。

2.冻干设备要求：

冷阱盘管表面温度≤-60℃

板层温度≤-45℃，温度均一性±1℃（性能详细说明及验证方案咨询金畔生物技术人员）

可做压升测试（冻干生产前，做泄漏率测试）

3.环境要求：

溶液分装及配置尽量在万级层流保护下进行，环境空间尘埃掉落进溶液中成为冻干过程的晶核，影响溶液的结晶的过冷度，导致产品质量不一致性。

4.真空控制

掺气方式：建议掺入气体为高纯氮气

5.冻干试剂 MIX 工艺参数设定参考（冻干设备升华效率≥1mm/小时）

6.实验过程中请使用RNase free耗材。

7.为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

8.本产品仅作科研用途！

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