PNGase F去糖基化试剂盒
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PNGase F去糖基化试剂盒(P2318M)
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| P2318S | PNGase F去糖基化试剂盒 | 25次 | 498.00元 |
| P2318M | PNGase F去糖基化试剂盒 | 100次 | 1668.00元 |
| P2318L | PNGase F去糖基化试剂盒 | 500次 | 6698.00元 |
碧云天生产的PNGase F去糖基化试剂盒(PNGase F Deglycosylation Kit)，又称PNGase F聚糖切割试剂盒(PNGase F Glycan Cleavage Kit)或PNGase F释放试剂盒(PNGase F Releasing Kit)，是一种去糖基化试剂盒，可在天然或变性条件下从糖蛋白或糖多肽中切割N-糖苷键，从而去除N-聚糖链。
PNGase F，即Peptide N-Glycosidase F，中文名称为N-糖酰胺水解酶F，简称糖基肽酶F，是一种通过E.coli重组表达来源于Elizabethkingia miricola(formerly Flavobacterium meningosepticum)的糖基肽酶。糖基肽酶F可以在几乎所有类型的N-多糖如高甘露糖(High mannose)、混合型和复杂寡聚糖(Hybrid and complex oligosaccharides)的最内端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc, N-acetylglucosamine)和天冬酰胺(Asn)残基的连接处切割，从而移除N-寡聚糖(N-linked oligosaccharides)，将蛋白和糖链修饰分开(图1) [1]，可用于抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去除N-糖基化修饰反应。另外Concanavalin A磁珠分离细胞或膜蛋白后，可使用PNGase F酶进行糖基的切除，从而使糖蛋白从Concanavalin A磁珠上解离下来，对于后续膜蛋白的质谱分析有很大帮助[2]。本糖基肽酶F的N端带有His-tag，可以通过相应的His抗体琼脂糖凝胶、磁珠或镍柱吸附去除。
图1. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)移除N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的示意图。糖链可以在图中戊糖(pentasaccharide)的R1、R2和R3位置延伸。R1位置只能是空缺或α-6 fucose，不能是α-3 fucose，否则就不能被PNGase F切割。R2和R3位置可以是任意的单糖或多糖。
糖基化修饰(Glycosylation)是一种蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)，几乎存在于所有生物体中，包括真核生物、真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaea)。糖基化修饰的多样性会改变蛋白的质量和电荷，在蛋白质分类、免疫识别、受体结合、炎症、致病性和许多其他过程中发挥着关键的生物功能[3-5]。最新的研究表明，核酸也存在糖基化修饰。
本试剂盒中PNGase F的基本信息如下表：
| 蛋白信息(About this protein) | |
| 名称(Name) | Peptide N-Glycosidase F (PNGase F)，糖基肽酶F |
| 别名(Synonyms) | N-糖酰胺水解酶F，N-糖苷酶 F，Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-D-glucosaminyl) asparagine amidase F, Glycopeptide N-glycosidase, N-glycanase |
| CAS号(CAS No.) | 83534-39-8 |
| 分子量(MW) | 36kDa |
| 外观(Physical appearance) | Liquid |
| 活性(Biological activity) | 500U/μl |
| 活力单位(Unit definition) | One unit is defined as the amount of enzyme required to remove >95% of the carbohydrate from 10μg of denatured RNase B in 1 hour at 37℃ in a total reaction volume of 10μl. |
| 纯度(Purity) | ≥95% by SDS-PAGE, protease-free. |
| 产品用途(Applications) | 1. 抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去N-糖基化修饰； 2. 表征蛋白是否存在N-糖基化修饰。 |
PNGase F最佳酶切温度为37℃，在较宽的pH范围(6.0-10.0)，在较宽的温度范围(4-50℃)，较宽的离子强度范围(0-1M NaCl)内均具有较高的酶活性。本产品与国外同类产品Competitor N相比，去除蛋白糖基的效果基本一致(图2)。
PNGase F储存液: 10mM Tris (pH7.4), 50mM NaCl, 5mM EDTA。储存液不含甘油，便于HPLC方法优化色谱条件。
Reaction Buffer (10X): 500mM Sodium Phosphate (pH7.5)。
本试剂盒用于去除糖蛋白或糖肽的N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的酶切反应时，如果按照每100μg糖蛋白使用1μl (500U/μl)在37℃反应1小时，本产品小、中、大包装分别可以用于2.5mg、5mg和25mg糖蛋白的N-糖苷移除，相当于25、100和500次反应。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318S-1 | PNGase F (500U/μl) | 25μl |
| P2318S-2 | Reaction Buffer (10X) | 100μl |
| P2318S-3 | Denaturing Buffer (10X) | 50μl |
| P2318S-4 | Renaturing Buffer (10X) | 100μl |
| － | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318M-1 | PNGase F (500U/μl) | 100μl |
| P2318M-2 | Reaction Buffer (10X) | 400μl |
| P2318M-3 | Denaturing Buffer (10X) | 200μl |
| P2318M-4 | Renaturing Buffer (10X) | 400μl |
| － | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318L-1 | PNGase F (500U/μl) | 500μl |
| P2318L-2 | Reaction Buffer (10X) | 2ml |
| P2318L-3 | Denaturing Buffer (10X) | 1ml |
| P2318L-4 | Renaturing Buffer (10X) | 2ml |
| － | 说明书 | 1份 |
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
PNGase F不能水解含有core α1-3 Fucose的N-糖苷(常见于植物及昆虫糖蛋白，此时需要使用PNGase A)。
超纯水推荐选购ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择相应的去糖基化修饰反应。本试剂盒去除变性和非变性蛋白的N-糖基化修饰的效果如图3所示。
图3. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)去除蛋白N-糖基化修饰效果图。在20μl反应体系中，加入10µg变性(Denaturing)或非变性(Non-Denaturing)的N-糖基化修饰蛋白(含有4个N-linked糖基化修饰)及相应量的PNGase F，37℃孵育1小时后，加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳，Marker为BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，并经BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
1.变性去N-糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)：
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择相应的去糖基化修饰反应。本试剂盒去除变性和非变性蛋白的N-糖基化修饰的效果如图3所示。
图3. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)去除蛋白N-糖基化修饰效果图。在20μl反应体系中，加入10µg变性(Denaturing)或非变性(Non-Denaturing)的N-糖基化修饰蛋白(含有4个N-linked糖基化修饰)及相应量的PNGase F，37℃孵育1小时后，加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳，Marker为BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，并经BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。1.变性去N-糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)：
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
| Component | Volume (μl) |
| Protein (10-100μg) | X |
| Denaturing Buffer (10X) | 1 |
| Ultrapure Water | To 10 |
注：因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
b.100℃加热10分钟，使蛋白充分变性。
c.置于冰浴，冷却至少10秒，10,000g离心3-5秒，确保所有溶液聚集于管底。
d.向上述10μl变性体系中，加入2μl Reaction Buffer (10X)，2μl Renaturing Buffer (10X)和6μl H2O，充分混匀。
e.加入1μl PNGase F (500U/μl)，充分混匀，37℃孵育1-4小时。
注1：如果蛋白量比较少，也可以用1X Reaction Buffer对PNGase F进行适当稀释后使用。
注2：因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
f.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，使用BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0468)进行电泳检测和考马斯亮蓝(P0017F)染色。
g.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。
2.非变性去N-糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)：
进行非变性去N-糖基化修饰反应时，建议平行做一组变性去N-糖基化修饰反应，以便提供完全去除N-糖基化修饰蛋白的阳性对照。可以通过比较非变性反应与变性反应，以确定非变性反应的去N-糖基化程度。
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
| Component | Volume (μl) |
| Protein (10-100μg) | X |
| Reaction Buffer (10X) | 2 |
| PNGase F (500U/μl) | 1 |
| Ultrapure Water | To 20 |
注：因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
b.37℃孵育4-24小时。
注：因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
c.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，使用 BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0468)进行电泳检测和考马斯亮蓝(P0017F)染色。
d.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。
参考文献：
1.Elder JH, Alexander S. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982. 79(15):4540-4.
2.Lee YC, Srajer Gajdosik M, Josic D, Lin SH. Methods Mol Biol. 2012. 909:29-41.
3.Drickamer K, Taylor ME. Introduction to Glycobiology (2nd ed.). Oxford University Press, USA. 2006, ISBN: 978-0-19-928278-4.
4.Lechner J, Wieland F. Annu Rev Biochem. 1989. 58:173-94.
5.Messner P. Glycoconj J. 1997. 14(1):3-11.
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| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318S | PNGase F去糖基化试剂盒 | 25次 |
| P2318M | PNGase F去糖基化试剂盒 | 100次 |
| P2318L | PNGase F去糖基化试剂盒 | 500次 |
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酵母重组表达N-糖苷酶 F(PNGase F,Recombinant)
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产品简介
N-糖苷酶 F (PNGase F)是一种酰胺水解酶，经过和平空间站伊丽莎菌克隆，主要由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌。翌圣酵母重组表达N-糖苷酶 F（比活性：750000 U/mL），可以裂解由天冬酰胺连接的高甘露糖、杂合和复杂的寡糖糖蛋白。PNGase F的切割位点为糖蛋白内侧N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基之间的酰胺键，同时将酶解后蛋白上的天冬氨酰转化为天冬氨酸。本产品带his标签，常应用于抗体及其相关蛋白完全去糖基化。
另外，我司还提供其他类型的糖苷酶，包括酵母重组表达的N-糖苷酶 F（Cat#20407JP，比活性：100000 U/mL），糖苷内切酶H（Cat#20414JP），糖苷内切酶S（Cat#20413JP）。
产品信息
|
编号 |
组分名称 |
20415JP01 |
20415JP02 |
|
20415-A |
PNGase F |
15 KU |
75 KU |
|
20415-B1 |
Buffer 1（10×） |
150 μL |
750 μL |
|
20415–B2 |
Buffer 2（10×） |
300 μL |
1500 μL |
|
20415–B3 |
10% NP-40 |
300 μL |
1500 μL |
产品性质
|
中文别名（Chinese synonym） |
N-糖酰胺酶F；N-糖苷酶 F |
|
英文别名（English synonym） |
PNGase F |
|
来源（Source） |
酵母重组表达 |
|
分子量（Molecular weight） |
36 kDa |
|
比活性（Specific activity） |
750000 U/mL |
|
缓冲液组分（Buffer） |
20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA,50% Glycerol |
|
酶活定义（Unit Definition） |
1个酶活力单位指在10 μL的反应体系中，37℃条件下1小时从10 μg变性RNase B中除去超过95%的碳水化合物所需要的酶量。 |
储存条件
-15~-25℃保存，有效期1年。
使用说明
- 变性条件下蛋白质去糖基化
1）在水中加入1 μL Buffer 1和目标糖蛋白（1-20 μg），至终体积10 μL；
2）100℃温度下煮沸10 min使其变性，冰上冷却，离心10秒；
3）加入2 μL的Buffer 2、2 μL的10％NP-40、6 μL去离子水，总反应体积20 μL；
4）加入0.2~0.5 μL的PNGase，轻轻混匀。在37℃孵育1-3 h。
- 非变性条件下蛋白质去糖基化
1）在水中加入2 μL的Buffer 2和目标糖蛋白（1-20 μg）至最终体积为 20 μL。
2）加入 0.5~1 μL 的PNGase F, 轻轻混匀。
3）37°C 孵育 4-24 h。
注意：在变性条件下大多数底物能够更好的去糖基化，在非变性条件下可能需要增加PNGase F的量和延长孵育时间。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20230205
产品简介
N-糖苷酶 F (PNGase F)是一种酰胺水解酶，经过和平空间站伊丽莎菌克隆，主要由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌。翌圣酵母重组表达N-糖苷酶 F（比活性：750000 U/mL），可以裂解由天冬酰胺连接的高甘露糖、杂合和复杂的寡糖糖蛋白。PNGase F的切割位点为糖蛋白内侧N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基之间的酰胺键，同时将酶解后蛋白上的天冬氨酰转化为天冬氨酸。本产品带his标签，常应用于抗体及其相关蛋白完全去糖基化。
另外，我司还提供其他类型的糖苷酶，包括酵母重组表达的N-糖苷酶 F（Cat#20407JP，比活性：100000 U/mL），糖苷内切酶H（Cat#20414JP），糖苷内切酶S（Cat#20413JP）。
产品信息
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编号 |
组分名称 |
20415JP01 |
20415JP02 |
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20415-A |
PNGase F |
15 KU |
75 KU |
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20415-B1 |
Buffer 1（10×） |
150 μL |
750 μL |
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20415–B2 |
Buffer 2（10×） |
300 μL |
1500 μL |
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20415–B3 |
10% NP-40 |
300 μL |
1500 μL |
产品性质
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中文别名（Chinese synonym） |
N-糖酰胺酶F；N-糖苷酶 F |
|
英文别名（English synonym） |
PNGase F |
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来源（Source） |
酵母重组表达 |
|
分子量（Molecular weight） |
36 kDa |
|
比活性（Specific activity） |
750000 U/mL |
|
缓冲液组分（Buffer） |
20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA,50% Glycerol |
|
酶活定义（Unit Definition） |
1个酶活力单位指在10 μL的反应体系中，37℃条件下1小时从10 μg变性RNase B中除去超过95%的碳水化合物所需要的酶量。 |
储存条件
-15~-25℃保存，有效期1年。
使用说明
- 变性条件下蛋白质去糖基化
1）在水中加入1 μL Buffer 1和目标糖蛋白（1-20 μg），至终体积10 μL；
2）100℃温度下煮沸10 min使其变性，冰上冷却，离心10秒；
3）加入2 μL的Buffer 2、2 μL的10％NP-40、6 μL去离子水，总反应体积20 μL；
4）加入0.2~0.5 μL的PNGase，轻轻混匀。在37℃孵育1-3 h。
- 非变性条件下蛋白质去糖基化
1）在水中加入2 μL的Buffer 2和目标糖蛋白（1-20 μg）至最终体积为 20 μL。
2）加入 0.5~1 μL 的PNGase F, 轻轻混匀。
3）37°C 孵育 4-24 h。
注意：在变性条件下大多数底物能够更好的去糖基化，在非变性条件下可能需要增加PNGase F的量和延长孵育时间。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20230205
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PNGase F(N-糖酰胺酶F/肽N-糖苷酶 F) 去糖基化酶
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- 糖苷酶 F (PNGase F)是一种酰胺水解酶，经过和平空间站伊丽莎菌克隆，主要由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌。翌圣N-糖苷酶 F (PNGase F)在酵母中重组表达（比活性：100000 U/mL），可以裂解由天冬酰胺连接的高甘露糖、杂合和复杂的寡糖糖蛋白。PNGase F的切割位点为糖蛋白内侧N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基之间的酰胺键，同时将酶解后蛋白上的天冬氨酰转化为天冬氨酸。本产品带his标签，常应用于抗体及其相关蛋白完全去糖基化。
另外，我司还提供其他类型的糖苷酶，包括酵母重组表达的N-糖苷酶 F（Cat#20415JP，比活性：750000 U/mL），内切糖苷酶H（Cat#20414JP），内切糖苷酶S（Cat#20413JP）。
产品信息
|
编号 |
组分名称 |
组分成分 |
20407JP01 |
20407JP02 |
|
20407-A |
PNGase F |
PNGase F |
15000 U |
75000 U |
|
20407-B1 |
Buffer 1（10×） |
5% SDS; 400 mM DTT |
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750 μL |
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20407–B2 |
Buffer 2（10×） |
200 mM Tris, PH 7.5 |
300 μL |
1500 μL |
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20407–B3 |
10% NP-40 |
10% NP-40 in MilliQ-H2O |
300 μL |
1500 μL |
产品性质
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中文别名（Chinese synonym） |
N-糖酰胺酶F；N-糖苷酶 F |
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英文别名（English synonym） |
PNGase F |
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来源（Source） |
酵母重组表达 |
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分子量（Molecular weight） |
36 kDa |
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比活性（Specific activity） |
100000 U/mL |
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缓冲液组分（Buffer） |
20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% Glycerol |
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酶活定义（Unit Definition） |
1个酶活力单位指在10 μL的反应体系中，37℃条件下1小时从10 μg变性RNase B中除去超过95%的碳水化合物所需要的酶量。 |
储存条件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用方法
1、变性条件下蛋白质去糖基化：
1）在水中加入1 μL Buffer 1和目标糖蛋白（1-20 μg），至终体积10 μL；
2）100℃温度下煮沸10 min使其变性，冰上冷却，离心10秒；
- 加入2 μL的Buffer 2、2 μL的10％NP-40、6 μL去离子水，总反应体积20 μL；
- 加入1-2 μL的PNGase，轻轻混匀。在37℃孵育1-3 h。
2、非变性条件下蛋白质去糖基化：
1）在水中加入2 μL的Buffer 2和目标糖蛋白（1-20 μg）至最终体积为 20 μL。
2）加入 2~5 μL 的 PNGase F, 轻轻混匀。
3）37°C 孵育 4-24 h。
注意：在变性条件下大多数底物能够更好的去糖基化，在非变性条件下可能需要增加PNGase F的量和延长孵育时间。
注意事项
1. PNGase F建议搭配我司提供的配套缓冲液使用，按我司说明书建议的操作量配套缓冲液足够。如您由于使用体系造成配套缓冲液不足，可咨询当地销售进行购买（Cat#20407-B, 包含20407-B1（750 μL）、20407-B2（1500 μL）、20407-B3（1500 μL））
2. 本产品仅作科研用途。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20240119
产品简介
- 糖苷酶 F (PNGase F)是一种酰胺水解酶，经过和平空间站伊丽莎菌克隆，主要由脑膜炎脓杆菌等革兰氏阴性菌分泌。翌圣N-糖苷酶 F (PNGase F)在酵母中重组表达（比活性：100000 U/mL），可以裂解由天冬酰胺连接的高甘露糖、杂合和复杂的寡糖糖蛋白。PNGase F的切割位点为糖蛋白内侧N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和天冬酰氨残基之间的酰胺键，同时将酶解后蛋白上的天冬氨酰转化为天冬氨酸。本产品带his标签，常应用于抗体及其相关蛋白完全去糖基化。
另外，我司还提供其他类型的糖苷酶，包括酵母重组表达的N-糖苷酶 F（Cat#20415JP，比活性：750000 U/mL），内切糖苷酶H（Cat#20414JP），内切糖苷酶S（Cat#20413JP）。
产品信息
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编号 |
组分名称 |
组分成分 |
20407JP01 |
20407JP02 |
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20407-A |
PNGase F |
PNGase F |
15000 U |
75000 U |
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20407-B1 |
Buffer 1（10×） |
5% SDS; 400 mM DTT |
150 μL |
750 μL |
|
20407–B2 |
Buffer 2（10×） |
200 mM Tris, PH 7.5 |
300 μL |
1500 μL |
|
20407–B3 |
10% NP-40 |
10% NP-40 in MilliQ-H2O |
300 μL |
1500 μL |
产品性质
|
中文别名（Chinese synonym） |
N-糖酰胺酶F；N-糖苷酶 F |
|
英文别名（English synonym） |
PNGase F |
|
来源（Source） |
酵母重组表达 |
|
分子量（Molecular weight） |
36 kDa |
|
比活性（Specific activity） |
100000 U/mL |
|
缓冲液组分（Buffer） |
20 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50% Glycerol |
|
酶活定义（Unit Definition） |
1个酶活力单位指在10 μL的反应体系中，37℃条件下1小时从10 μg变性RNase B中除去超过95%的碳水化合物所需要的酶量。 |
储存条件
-25~-15℃保存，有效期1年。
使用方法
1、变性条件下蛋白质去糖基化：
1）在水中加入1 μL Buffer 1和目标糖蛋白（1-20 μg），至终体积10 μL；
2）100℃温度下煮沸10 min使其变性，冰上冷却，离心10秒；
- 加入2 μL的Buffer 2、2 μL的10％NP-40、6 μL去离子水，总反应体积20 μL；
- 加入1-2 μL的PNGase，轻轻混匀。在37℃孵育1-3 h。
2、非变性条件下蛋白质去糖基化：
1）在水中加入2 μL的Buffer 2和目标糖蛋白（1-20 μg）至最终体积为 20 μL。
2）加入 2~5 μL 的 PNGase F, 轻轻混匀。
3）37°C 孵育 4-24 h。
注意：在变性条件下大多数底物能够更好的去糖基化，在非变性条件下可能需要增加PNGase F的量和延长孵育时间。
注意事项
1. PNGase F建议搭配我司提供的配套缓冲液使用，按我司说明书建议的操作量配套缓冲液足够。如您由于使用体系造成配套缓冲液不足，可咨询当地销售进行购买（Cat#20407-B, 包含20407-B1（750 μL）、20407-B2（1500 μL）、20407-B3（1500 μL））
2. 本产品仅作科研用途。
3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
Ver.CN20240119
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PNGase F去糖基化试剂盒(P2318S)
PNGase F去糖基化试剂盒
一键复制产品信息 产品编号: P2318S
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价格: ¥ 498.00
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| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| P2318S | PNGase F去糖基化试剂盒 | 25次 | 498.00元 |
| P2318M | PNGase F去糖基化试剂盒 | 100次 | 1668.00元 |
| P2318L | PNGase F去糖基化试剂盒 | 500次 | 6698.00元 |
碧云天生产的PNGase F去糖基化试剂盒(PNGase F Deglycosylation Kit)，又称PNGase F聚糖切割试剂盒(PNGase F Glycan Cleavage Kit)或PNGase F释放试剂盒(PNGase F Releasing Kit)，是一种去糖基化试剂盒，可在天然或变性条件下从糖蛋白或糖多肽中切割N-糖苷键，从而去除N-聚糖链。
PNGase F，即Peptide N-Glycosidase F，中文名称为N-糖酰胺水解酶F，简称糖基肽酶F，是一种通过E.coli重组表达来源于Elizabethkingia miricola(formerly Flavobacterium meningosepticum)的糖基肽酶。糖基肽酶F可以在几乎所有类型的N-多糖如高甘露糖(High mannose)、混合型和复杂寡聚糖(Hybrid and complex oligosaccharides)的最内端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc, N-acetylglucosamine)和天冬酰胺(Asn)残基的连接处切割，从而移除N-寡聚糖(N-linked oligosaccharides)，将蛋白和糖链修饰分开(图1) [1]，可用于抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去除N-糖基化修饰反应。另外Concanavalin A磁珠分离细胞或膜蛋白后，可使用PNGase F酶进行糖基的切除，从而使糖蛋白从Concanavalin A磁珠上解离下来，对于后续膜蛋白的质谱分析有很大帮助[2]。本糖基肽酶F的N端带有His-tag，可以通过相应的His抗体琼脂糖凝胶、磁珠或镍柱吸附去除。
图1. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)移除N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的示意图。糖链可以在图中戊糖(pentasaccharide)的R1、R2和R3位置延伸。R1位置只能是空缺或α-6 fucose，不能是α-3 fucose，否则就不能被PNGase F切割。R2和R3位置可以是任意的单糖或多糖。
糖基化修饰(Glycosylation)是一种蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)，几乎存在于所有生物体中，包括真核生物、真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaea)。糖基化修饰的多样性会改变蛋白的质量和电荷，在蛋白质分类、免疫识别、受体结合、炎症、致病性和许多其他过程中发挥着关键的生物功能[3-5]。最新的研究表明，核酸也存在糖基化修饰。
本试剂盒中PNGase F的基本信息如下表：
| 蛋白信息(About this protein) | |
| 名称(Name) | Peptide N-Glycosidase F (PNGase F)，糖基肽酶F |
| 别名(Synonyms) | N-糖酰胺水解酶F，N-糖苷酶 F，Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-D-glucosaminyl) asparagine amidase F, Glycopeptide N-glycosidase, N-glycanase |
| CAS号(CAS No.) | 83534-39-8 |
| 分子量(MW) | 36kDa |
| 外观(Physical appearance) | Liquid |
| 活性(Biological activity) | 500U/μl |
| 活力单位(Unit definition) | One unit is defined as the amount of enzyme required to remove >95% of the carbohydrate from 10μg of denatured RNase B in 1 hour at 37℃ in a total reaction volume of 10μl. |
| 纯度(Purity) | ≥95% by SDS-PAGE, protease-free. |
| 产品用途(Applications) | 1. 抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去N-糖基化修饰； 2. 表征蛋白是否存在N-糖基化修饰。 |
PNGase F最佳酶切温度为37℃，在较宽的pH范围(6.0-10.0)，在较宽的温度范围(4-50℃)，较宽的离子强度范围(0-1M NaCl)内均具有较高的酶活性。本产品与国外同类产品Competitor N相比，去除蛋白糖基的效果基本一致(图2)。
PNGase F储存液: 10mM Tris (pH7.4), 50mM NaCl, 5mM EDTA。储存液不含甘油，便于HPLC方法优化色谱条件。
Reaction Buffer (10X): 500mM Sodium Phosphate (pH7.5)。
本试剂盒用于去除糖蛋白或糖肽的N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的酶切反应时，如果按照每100μg糖蛋白使用1μl (500U/μl)在37℃反应1小时，本产品小、中、大包装分别可以用于2.5mg、5mg和25mg糖蛋白的N-糖苷移除，相当于25、100和500次反应。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318S-1 | PNGase F (500U/μl) | 25μl |
| P2318S-2 | Reaction Buffer (10X) | 100μl |
| P2318S-3 | Denaturing Buffer (10X) | 50μl |
| P2318S-4 | Renaturing Buffer (10X) | 100μl |
| － | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318M-1 | PNGase F (500U/μl) | 100μl |
| P2318M-2 | Reaction Buffer (10X) | 400μl |
| P2318M-3 | Denaturing Buffer (10X) | 200μl |
| P2318M-4 | Renaturing Buffer (10X) | 400μl |
| － | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318L-1 | PNGase F (500U/μl) | 500μl |
| P2318L-2 | Reaction Buffer (10X) | 2ml |
| P2318L-3 | Denaturing Buffer (10X) | 1ml |
| P2318L-4 | Renaturing Buffer (10X) | 2ml |
| － | 说明书 | 1份 |
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
PNGase F不能水解含有core α1-3 Fucose的N-糖苷(常见于植物及昆虫糖蛋白，此时需要使用PNGase A)。
超纯水推荐选购ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择相应的去糖基化修饰反应。本试剂盒去除变性和非变性蛋白的N-糖基化修饰的效果如图3所示。
图3. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)去除蛋白N-糖基化修饰效果图。在20μl反应体系中，加入10µg变性(Denaturing)或非变性(Non-Denaturing)的N-糖基化修饰蛋白(含有4个N-linked糖基化修饰)及相应量的PNGase F，37℃孵育1小时后，加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳，Marker为BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，并经BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
1.变性去N-糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)：
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择相应的去糖基化修饰反应。本试剂盒去除变性和非变性蛋白的N-糖基化修饰的效果如图3所示。
图3. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)去除蛋白N-糖基化修饰效果图。在20μl反应体系中，加入10µg变性(Denaturing)或非变性(Non-Denaturing)的N-糖基化修饰蛋白(含有4个N-linked糖基化修饰)及相应量的PNGase F，37℃孵育1小时后，加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳，Marker为BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，并经BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。1.变性去N-糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)：
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
| Component | Volume (μl) |
| Protein (10-100μg) | X |
| Denaturing Buffer (10X) | 1 |
| Ultrapure Water | To 10 |
注：因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
b.100℃加热10分钟，使蛋白充分变性。
c.置于冰浴，冷却至少10秒，10,000g离心3-5秒，确保所有溶液聚集于管底。
d.向上述10μl变性体系中，加入2μl Reaction Buffer (10X)，2μl Renaturing Buffer (10X)和6μl H2O，充分混匀。
e.加入1μl PNGase F (500U/μl)，充分混匀，37℃孵育1-4小时。
注1：如果蛋白量比较少，也可以用1X Reaction Buffer对PNGase F进行适当稀释后使用。
注2：因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
f.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，使用BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0468)进行电泳检测和考马斯亮蓝(P0017F)染色。
g.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。
2.非变性去N-糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)：
进行非变性去N-糖基化修饰反应时，建议平行做一组变性去N-糖基化修饰反应，以便提供完全去除N-糖基化修饰蛋白的阳性对照。可以通过比较非变性反应与变性反应，以确定非变性反应的去N-糖基化程度。
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
| Component | Volume (μl) |
| Protein (10-100μg) | X |
| Reaction Buffer (10X) | 2 |
| PNGase F (500U/μl) | 1 |
| Ultrapure Water | To 20 |
注：因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
b.37℃孵育4-24小时。
注：因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
c.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，使用 BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0468)进行电泳检测和考马斯亮蓝(P0017F)染色。
d.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。
参考文献：
1.Elder JH, Alexander S. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982. 79(15):4540-4.
2.Lee YC, Srajer Gajdosik M, Josic D, Lin SH. Methods Mol Biol. 2012. 909:29-41.
3.Drickamer K, Taylor ME. Introduction to Glycobiology (2nd ed.). Oxford University Press, USA. 2006, ISBN: 978-0-19-928278-4.
4.Lechner J, Wieland F. Annu Rev Biochem. 1989. 58:173-94.
5.Messner P. Glycoconj J. 1997. 14(1):3-11.
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| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318S | PNGase F去糖基化试剂盒 | 25次 |
| P2318M | PNGase F去糖基化试剂盒 | 100次 |
| P2318L | PNGase F去糖基化试剂盒 | 500次 |
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PNGase F去糖基化试剂盒(P2318L)
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| P2318M | PNGase F去糖基化试剂盒 | 100次 | 1668.00元 |
| P2318L | PNGase F去糖基化试剂盒 | 500次 | 6698.00元 |
碧云天生产的PNGase F去糖基化试剂盒(PNGase F Deglycosylation Kit)，又称PNGase F聚糖切割试剂盒(PNGase F Glycan Cleavage Kit)或PNGase F释放试剂盒(PNGase F Releasing Kit)，是一种去糖基化试剂盒，可在天然或变性条件下从糖蛋白或糖多肽中切割N-糖苷键，从而去除N-聚糖链。
PNGase F，即Peptide N-Glycosidase F，中文名称为N-糖酰胺水解酶F，简称糖基肽酶F，是一种通过E.coli重组表达来源于Elizabethkingia miricola(formerly Flavobacterium meningosepticum)的糖基肽酶。糖基肽酶F可以在几乎所有类型的N-多糖如高甘露糖(High mannose)、混合型和复杂寡聚糖(Hybrid and complex oligosaccharides)的最内端N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc, N-acetylglucosamine)和天冬酰胺(Asn)残基的连接处切割，从而移除N-寡聚糖(N-linked oligosaccharides)，将蛋白和糖链修饰分开(图1) [1]，可用于抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去除N-糖基化修饰反应。另外Concanavalin A磁珠分离细胞或膜蛋白后，可使用PNGase F酶进行糖基的切除，从而使糖蛋白从Concanavalin A磁珠上解离下来，对于后续膜蛋白的质谱分析有很大帮助[2]。本糖基肽酶F的N端带有His-tag，可以通过相应的His抗体琼脂糖凝胶、磁珠或镍柱吸附去除。
图1. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)移除N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的示意图。糖链可以在图中戊糖(pentasaccharide)的R1、R2和R3位置延伸。R1位置只能是空缺或α-6 fucose，不能是α-3 fucose，否则就不能被PNGase F切割。R2和R3位置可以是任意的单糖或多糖。
糖基化修饰(Glycosylation)是一种蛋白质翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)，几乎存在于所有生物体中，包括真核生物、真细菌(Eubacteria)和古细菌(Archaea)。糖基化修饰的多样性会改变蛋白的质量和电荷，在蛋白质分类、免疫识别、受体结合、炎症、致病性和许多其他过程中发挥着关键的生物功能[3-5]。最新的研究表明，核酸也存在糖基化修饰。
本试剂盒中PNGase F的基本信息如下表：
| 蛋白信息(About this protein) | |
| 名称(Name) | Peptide N-Glycosidase F (PNGase F)，糖基肽酶F |
| 别名(Synonyms) | N-糖酰胺水解酶F，N-糖苷酶 F，Peptide-N(4)-(N-acetyl-beta-D-glucosaminyl) asparagine amidase F, Glycopeptide N-glycosidase, N-glycanase |
| CAS号(CAS No.) | 83534-39-8 |
| 分子量(MW) | 36kDa |
| 外观(Physical appearance) | Liquid |
| 活性(Biological activity) | 500U/μl |
| 活力单位(Unit definition) | One unit is defined as the amount of enzyme required to remove >95% of the carbohydrate from 10μg of denatured RNase B in 1 hour at 37℃ in a total reaction volume of 10μl. |
| 纯度(Purity) | ≥95% by SDS-PAGE, protease-free. |
| 产品用途(Applications) | 1. 抗体、免疫球蛋白融合蛋白或其它糖蛋白的体外去N-糖基化修饰； 2. 表征蛋白是否存在N-糖基化修饰。 |
PNGase F最佳酶切温度为37℃，在较宽的pH范围(6.0-10.0)，在较宽的温度范围(4-50℃)，较宽的离子强度范围(0-1M NaCl)内均具有较高的酶活性。本产品与国外同类产品Competitor N相比，去除蛋白糖基的效果基本一致(图2)。
PNGase F储存液: 10mM Tris (pH7.4), 50mM NaCl, 5mM EDTA。储存液不含甘油，便于HPLC方法优化色谱条件。
Reaction Buffer (10X): 500mM Sodium Phosphate (pH7.5)。
本试剂盒用于去除糖蛋白或糖肽的N-糖苷(N-linked oligosaccharides)的酶切反应时，如果按照每100μg糖蛋白使用1μl (500U/μl)在37℃反应1小时，本产品小、中、大包装分别可以用于2.5mg、5mg和25mg糖蛋白的N-糖苷移除，相当于25、100和500次反应。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318S-1 | PNGase F (500U/μl) | 25μl |
| P2318S-2 | Reaction Buffer (10X) | 100μl |
| P2318S-3 | Denaturing Buffer (10X) | 50μl |
| P2318S-4 | Renaturing Buffer (10X) | 100μl |
| － | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318M-1 | PNGase F (500U/μl) | 100μl |
| P2318M-2 | Reaction Buffer (10X) | 400μl |
| P2318M-3 | Denaturing Buffer (10X) | 200μl |
| P2318M-4 | Renaturing Buffer (10X) | 400μl |
| － | 说明书 | 1份 |
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| P2318L-1 | PNGase F (500U/μl) | 500μl |
| P2318L-2 | Reaction Buffer (10X) | 2ml |
| P2318L-3 | Denaturing Buffer (10X) | 1ml |
| P2318L-4 | Renaturing Buffer (10X) | 2ml |
| － | 说明书 | 1份 |
保存条件：
-20℃保存，一年有效。
注意事项：
PNGase F不能水解含有core α1-3 Fucose的N-糖苷(常见于植物及昆虫糖蛋白，此时需要使用PNGase A)。
超纯水推荐选购ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择相应的去糖基化修饰反应。本试剂盒去除变性和非变性蛋白的N-糖基化修饰的效果如图3所示。
图3. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)去除蛋白N-糖基化修饰效果图。在20μl反应体系中，加入10µg变性(Denaturing)或非变性(Non-Denaturing)的N-糖基化修饰蛋白(含有4个N-linked糖基化修饰)及相应量的PNGase F，37℃孵育1小时后，加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳，Marker为BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，并经BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
1.变性去N-糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)：
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
体外酶解去糖基化修饰反应根据对糖蛋白或糖肽的处理方式不同，可分为变性去糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)和非变性去糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)。变性去糖基化修饰反应：蛋白质变性导致三级结构被破坏，内部序列暴露可以去除所有糖基化修饰；非变性去糖基化修饰反应：蛋白原始构象被保留，三级结构中暴露在外的糖苷被移除，但是处于内部的糖苷被保留，蛋白的酶活性或抗原性很可能不受影响。用户可根据实验目的选择相应的去糖基化修饰反应。本试剂盒去除变性和非变性蛋白的N-糖基化修饰的效果如图3所示。
图3. 碧云天PNGase F去糖基化试剂盒(P2318)去除蛋白N-糖基化修饰效果图。在20μl反应体系中，加入10µg变性(Denaturing)或非变性(Non-Denaturing)的N-糖基化修饰蛋白(含有4个N-linked糖基化修饰)及相应量的PNGase F，37℃孵育1小时后，加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，经BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(Tris-Gly, 4-20%, 10孔) (P0468)电泳，Marker为BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(6.5-270kD) (P0071/P0072)，并经BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液(P0017F)染色。实际效果会因样品种类、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。1.变性去N-糖基化修饰反应(Denaturing deglycosylation)：
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
| Component | Volume (μl) |
| Protein (10-100μg) | X |
| Denaturing Buffer (10X) | 1 |
| Ultrapure Water | To 10 |
注：因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
b.100℃加热10分钟，使蛋白充分变性。
c.置于冰浴，冷却至少10秒，10,000g离心3-5秒，确保所有溶液聚集于管底。
d.向上述10μl变性体系中，加入2μl Reaction Buffer (10X)，2μl Renaturing Buffer (10X)和6μl H2O，充分混匀。
e.加入1μl PNGase F (500U/μl)，充分混匀，37℃孵育1-4小时。
注1：如果蛋白量比较少，也可以用1X Reaction Buffer对PNGase F进行适当稀释后使用。
注2：因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
f.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，使用BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0468)进行电泳检测和考马斯亮蓝(P0017F)染色。
g.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。
2.非变性去N-糖基化修饰反应(Non-denaturing deglycosylation)：
进行非变性去N-糖基化修饰反应时，建议平行做一组变性去N-糖基化修饰反应，以便提供完全去除N-糖基化修饰蛋白的阳性对照。可以通过比较非变性反应与变性反应，以确定非变性反应的去N-糖基化程度。
a.按下表在1.5ml离心管中配制反应体系，并充分混匀。
| Component | Volume (μl) |
| Protein (10-100μg) | X |
| Reaction Buffer (10X) | 2 |
| PNGase F (500U/μl) | 1 |
| Ultrapure Water | To 20 |
注：因不同蛋白质所带有的N-linked糖基化修饰数目不同，可视情况调整蛋白加入量，以获得最佳的实验方案。
b.37℃孵育4-24小时。
注：因蛋白质本身以及糖基化修饰的不同，N-糖苷移除效率可能存在差异，可视情况适当调整PNGase F用量和反应时间，以获得最佳的实验效果。
c.加入4μl SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (P0289)，混匀后95℃加热5分钟，使用 BeyoGel™ Plus PAGE预制胶(P0468)进行电泳检测和考马斯亮蓝(P0017F)染色。
d.观察考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶，对比PNGase F处理前后蛋白样品分子量变化，观察蛋白样品去N-糖基化修饰效果。后续大量蛋白去糖基化修饰时，可以等比例放大酶切反应体系。
参考文献：
1.Elder JH, Alexander S. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982. 79(15):4540-4.
2.Lee YC, Srajer Gajdosik M, Josic D, Lin SH. Methods Mol Biol. 2012. 909:29-41.
3.Drickamer K, Taylor ME. Introduction to Glycobiology (2nd ed.). Oxford University Press, USA. 2006, ISBN: 978-0-19-928278-4.
4.Lechner J, Wieland F. Annu Rev Biochem. 1989. 58:173-94.
5.Messner P. Glycoconj J. 1997. 14(1):3-11.
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