Oligo dT 磁珠为表面包被有Oligo dT的1 μm磁性聚合物微球，具有单分散和磁响应性强等特点。磁珠通过Oligo dT与真核生物mRNA的poly A尾结构互补配对，快速高效从总RNA、细胞裂解物和带有poly A的体外转录RNA样本中分离纯化mRNA。纯化的mRNA可用于RT-PCR、cDNA文库构建、RACE、探针杂交和转录组测序等应用。

 

产品性质

基质	聚合物磁珠
配体	Oligo dT
平均粒径	1 μm
磁核	Fe3O4
壳层	聚合物
磁性类型	超顺磁性
应用方向	mRNA分离纯化
应用方式	手动/自动
dA30结合量	>300 pmol/mg 磁珠
mRNA结合量	~2 μg/mg磁珠
磁珠浓度	10 mg/mL
保存溶液	PBS, pH 7.4, 0.05% Proclin-300
保存条件	4℃
保质期	2年

 

运输和保存方法

冰袋运输。4℃储存，有效期2年。

 

注意事项

1. 磁珠严禁冷冻，否则可能导致磁珠碎裂，影响mRNA 纯化效果。

2. 所有用于mRNA提取的buffer和耗材都应该是RNase-free，操作过程中应佩戴一次性手套和口罩避免RNase的污染。

3. 磁珠取用前应恢复至室温，且充分混匀。

4. 若总RNA样本降解严重，无法得到高质量的mRNA。

5. 磁珠用量相对于样本量不可过低，否则会导致mRNA回收率低和rRNA残留过高。

6. 磁吸时间不应少于1min，磁吸后吸弃上清液时避免损失磁珠。

7. 洗脱时可能存在磁珠残留，吸取样本时应尽量避免吸入磁珠。

8. 提取到的mRNA最好立即用于RT-PCR。如果需要保存，建议将mRNA从磁珠上洗脱下来，可在洗脱液中添加RNase抑制剂，-80℃冻存。

 

实验前准备

1. 自配试剂

试剂名称	组分
结合液	20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA
洗涤液	10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA
洗脱液	Nuclease-Free Water 或 10 mM Tris-HCl, pH 7.5

注：所有试剂都使用DEPC水配制，为避免磁珠粘附管壁可在结合液和洗涤液中添加终浓度为0.01%的Tween-20。

2. 自备设备和耗材：磁性分离架，水浴锅或金属浴，冰浴，漩涡振荡器，旋转混合仪，1.5 mL离心管(RNase-free)，微量移液器及吸头(RNase-free)。

3. 将磁珠恢复至室温，且充分重悬。

4. 设置水浴锅或金属浴为65℃。

 

操作方法

以使用50 μL磁珠，从100 μg总RNA中纯化mRNA为例。可以根据样本用量按比例进行调整。

1. 使用DEPC水将100 μg总RNA的体积调整为100 μL。

   注：若总RNA的浓度低于1 μg/μL，可增加样本体积，并调节步骤6的结合液用量和样本体积相同；或者直接使用100 μL样本，以下步骤不变。

2. 将上述总RNA样本于65℃变性处理5 min，立即置于冰浴。

3. 吸取50 μL均匀重悬并恢复至室温的Oligo dT磁珠于1.5 mL离心管(RNase-free)，磁吸，吸弃保存液。

4. 使用100 μL结合液重悬磁珠，磁吸，吸弃上清液。

5. 重复步骤4。

6. 使用100 μL结合液重悬磁珠。

7. 将步骤2中处理好的总RNA样本加入磁悬液中，混匀，室温旋转混合10 min。

8. 磁吸，吸弃上清液。

9. 使用200 μL洗涤液重悬磁珠，磁吸，吸弃上清液。

10. 重复步骤9。

   注：使用10 μL移液器吸头尽量吸弃上清液。

11. 加入20-100 μL洗脱液，吹打重悬磁珠，室温混匀5min，磁吸，将纯化的mRNA溶液转移至新的EP管(RNase-free)。

    注：65℃-75℃加热洗脱，可增加洗脱效率。

 

检测分析

1. 总RNA中mRNA的含量一般为1%-5%, 可以使用Nanodrop或Qubit测量纯化的mRNA浓度。
2. 可以使用RT-qPCR或Agilent 2100 Bioanalyzer及配套的试剂检测rRNA残留情况。

HB230106