NHS-Activated MagBeads 是一种预活化的聚合物磁性微球，表面为NHS 基团修饰，能够与含氨基的蛋白或多肽的偶联，其主要用于亲和纯化或者分析检测抗体、抗原和其他生物分子。为任何所需蛋白质偶联到磁珠表面提供了一种便利的方式。与传统的羧基、氨基磁珠相比，表面含NHS基团的磁珠无需事先采EDC/NHS或戊二醛进行活化，只需简单地将含氨基的生物配体溶解于偶联缓冲液中，将蛋白溶液与磁珠孵育2-4h便可将生物配体，通过 NHS-酯化学共价偶联到磁珠上。这一过程不需要危险化学品或冗长的反应方案，具有操作简单、偶联条件温和、生物配体偶联快速高效的优点。

活化的磁珠含有能与伯胺反应以形成稳定的酰胺键的 N-羟基–琥珀酰亚胺 (NHS) 功能基团。一旦它们共价连接，固定的蛋白不会从磁珠表面浸出。在实验中使用制备的磁珠时，非特异性结合可忽略不计，因为在偶联程序中，非反应 NHS-酯基团被彻底封闭。NHS 活化磁珠可通过手动磁力架进行偶联和处理。偶联后，制备的磁珠通常用于亲和纯化程序。

该磁珠适用于含氨基的蛋白、抗体、酶、多肽、核酸等生物分子的共价偶联。偶联后，制备的磁珠可应用于免疫检测、免疫沉淀、免疫共沉淀、蛋白/抗体分离纯化等实验。该产品生物配基偶联效率高，可高效简单偶联且共价偶联稳定，可避免抗体与目标蛋白的共洗脱，其实际使用效果可替代DynaBeads Antibody Coupling kit。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃储存，有效期2年。

注意事项

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.本产品仅作科研用途！

使用方法

一、缓冲液配制

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。

清洗液：1 mM HCI

偶联液：0.2 M NaHCO₃, 0.5 M NaCI, pH8.0

封闭液：0.5 M 乙醇胺，0.5 M NaCI, pH8.3 或 0.1 M Tris, pH8.5

清洗液1：0.1 M乙酸–乙酸钠，0.5 M NaCI, pH3.0

清洗液 2：0.1 M Tris-HCI, 0.5 M NaCI, pH8.0

保护液: PBS , 0.01% Tween-20,0.02% NaN₃

【注】偶联液可以选择碳酸盐、磷酸盐等不含氨基的缓冲液体系。缓冲液体系中加入一定浓度的盐离子减少非特异性吸附。

二、样本制备

样品用偶联液溶解，浓度约5-10 mg/ml。

三、抗原偶联

1 .取适量磁珠，吸去保护液，用1 mM HCI清洗液清洗一次，再用偶联液清洗一次。磁珠加入清洗液，混匀后立刻放在磁力架上吸附，吸弃上清。可以选用预冷的溶液快速清洗，减少预活化介质的水解。

2. 溶解好的样品加入至清洗好的磁珠中，磁珠：样品溶液体积比约1:1-2。

3. 28°C振荡反应2-4 h或4°C过夜。确保磁珠悬浮起来，否则会大大影响偶联效率。

4. 反应完后收集偶联样品，以便检测偶联效率。去离子水清洗磁珠，加入2倍磁珠体积的封闭液，28°C振荡反应1 h。

【注】偶联后无法用紫外吸收测定上清蛋白浓度，建议用电泳或者BCA定量法检测偶联效率。

5. 将上述反应体系取出，流干其中的封闭液，用3倍磁珠体积的去离子水清洗磁珠，清洗液1、去离子水、清洗液2和去离子水重复冲洗2 次，然后以10 mg/ml的浓度保存在保护液中，于2-8°C保存。

四、纯化流程

以磁珠偶联抗体，纯化抗原为例的纯化步骤。

4.1缓冲液的准备

【注】所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤。

平衡/洗杂液：0.15 M NaCI, 20 mM Na₂HPO₄, pH 7.0

洗脱液：0.1 M甘氨酸，pH 3.0

中和液：1 M Tris-HCI, pH 8.5

4.2磁珠预处理  将偶联好的磁珠混合均匀，取计算量（根据上样量和磁珠载量计算）的磁珠悬浮液（后文均以100 μL为例），转移至离心管中，放置在磁分离器上，静置大约1 min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清液。再将离心管从磁分离器上取下来，加入与所取磁珠悬浮液等体积（100 μL）的平衡液，使用枪头反复吹打5次，将离心管置于磁分离器上，大约1min，待溶液变澄清后，用移液器吸弃上清液，重复洗涤2次。

4.3样品吸附  在预处理的磁珠中加入样品溶液，漩涡振荡均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，使样品和磁珠充分接触并吸附，混合30 min以上，置于磁分离器上，大约1min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。

4.4洗杂  向离心管中加入初始磁珠悬浮液5倍体积（500 μL）的洗杂液，振荡悬浮，混合1-2 min，然后置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。该操作重复两次。

4.5洗脱  在上述离心管中加入3-5倍悬浮液体积（300-500 μL）的洗脱液，用移液器吹打5次，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，5-10 min后，置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标蛋白。

4.6洗脱组分中和  向洗脱组分中加入洗脱体积十分之一的中和液，调节pH值至7.0-8.0。

4.7磁珠保存  使用后的磁珠用1 mL洗脱液重悬磁珠，然后置于磁分离器上，大约1 min，待溶液变澄清后，吸弃上清液。该操作重复两次。再加入1 mL 平衡液，悬浮磁珠，然后置于磁分离器上，大约1min,待溶液变澄清后，吸弃上清液。加入保护液至磁珠浓度为10 mg/mL, 置于2–8℃保存。

HB220324

Q：这种NHS聚合物的磁珠和NHS琼脂糖的磁珠的区别？

A：两者都是表面为NHS基团修饰的磁珠，能够与氨基的蛋白和其他分子形成稳定的肽键，用于亲和纯化或者分析检测抗体、抗原和其他生物分子。聚合物的磁珠一般粒径较小，为1-2μm，主要用于分析检测领域（如体外诊断、微生物检测、免疫沉淀、免疫共沉淀等）；而NHS琼脂糖磁珠是以天然的亲水性高分子琼脂糖为基材的多孔微球，粒径为30~100μm，主要用于分离纯化领域（如蛋白分离纯化、抗体分离纯化）。

Q：磁性微球可以反复使用吗？

A：偶联配体后可以反复使用。但不能更换配体。

Q：为什么储存温度是-20℃，偶联配体后保存温度又是2-8℃？

A：未使用的产品保护液是异丙醇，可以在-20℃中保存不结冰，偶联蛋白后为考虑蛋白稳定性且反复冻融影响填料性能，选择2-8℃保存。

Q：样品浓度达不到5mg/ml，一般卖的抗体是1mg/ml，可以吗？0.2mg/ml的抗体也可以偶联吗？

A：1mg/ml的浓度也是可以偶联的。0.2mg/ml浓度有点低，看下是否能超滤浓缩，低浓度样品的偶联效率无法作保证。推荐用于偶联的抗体浓度＞1mg/ml。

Q：NHS预活化磁珠的这个清洗液1的PH能改吗，一定要PH为3吗？

A：也可以用0.1M 甘氨酸，ph3.0作为清洗液。一般选择这个条件是模拟抗体纯化洗脱液的条件，先进行几次清洗 将结合力弱的蛋白去除，避免后续使用过程中的配体脱落。

Q：在文库的接头上偶连氨基后，是否能和NHS磁珠进行共价结合呢？有偶联方法吗？

A：这个理论上是可行的，关于这方面的应用我们暂时没有数据积累。这个与说明书中蛋白偶联步骤基本一致。样品需在不含伯氨基的离子缓冲液中，磁珠按照说明书中清洗步骤先用稀盐酸清洗然后用偶联液清洗，清洗结束后立即与样品混合接触，28℃偶联4h左右。样品浓度要求以及单位体积磁珠偶联的量，暂无数据。

Q：客户做的是蛋白质组学，蛋白溶液里会含有DNA,RNA，会干扰蛋白吸附吗？含核酸样品的偶联中 如何消除核酸样品的干扰？

A：不能这样操作的，DNA,RNA会有干扰。一般我们只用于纯品的偶联；如果是在NHS磁珠上先固定这蛋白对应的抗体，然后通过抗体结合蛋白， 可以去除多余的核酸。

Q:清洗液1：0.1 M乙酸–乙酸钠，0.5 M NaCI, pH3.0和清洗液 2：0.1 M Tris-HCI, 0.5 M NaCI, pH8.0，这两个清洗液只使用一个可以吗？

A：不可以，这个是模拟纯化条件的平衡和洗脱

Q:1mM Hcl或者欧联液清洗的目的？活化磁珠？2，如果加入PEG和nacl，磁珠是还有可能和蛋白偶联？

A：稀盐酸是清洗去除磁珠保护液。PEG和氯化钠理论不影响NHS偶联。