该试剂盒可以将Illumina试剂盒构建的双链线性文库转化为兼容华大智造测序平台的环状ssDNA文库。构建的文库可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 进行测序。

产品组分

运输与保存方法 

干冰运输。

所有组分-20°C保存，有效期1年。

*当运输条件、储存条件及使用方式都正确时，所有组分在有效期内均能保持完整活性。

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、样本要求及处理

2.1样本要求

样本为线性dsDNA文库，接头序列符合下列之一：

单index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

双index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

线性dsDNA文库插入片段范围为 100 ~ 500 bp，同时主带集中在±100 bp 以内。

2.2 样本量要求

 根据文库总量选择合适的线性dsDNA投入量，详见表1：

表1  线性dsDNA总量与浓度要求

2.3 转换PCR

不同线性 dsDNA 文库投入量，所需 PCR 循环也不相同，详见表2：

表2  不同线性dsDNA投入量PCR循环数推荐表

2.4 转换文库pooling要求

1. 不推荐在转换PCR前对线性dsDNA进行pooling。

2. 需将接头转换 PCR 产物混合测序，则 Sample Barcode Pooling 应遵循碱基平衡的原则：最佳平衡状态 ATGC 4种碱基的占比应分别为 25% ，若不能达到 25%，则要保证每个 cycle 都存在 ATGC 四种碱基序列，并且最少的碱基不应低于 12.5%，最多的碱基不应高于 62.5%。

3. 不同片段长度的文库不建议 pooling 环化。

4. 若样本所需数据量相同且长度相同，则可以等量混合，每个样本所需的质量按照公式1进行计算：

公式1混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量 (ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量 (ng）/混合的样本个数 N

5. 混合后接头转换 PCR 产物总量为 1 pmol，总体积最多为 40 μL；若文库不足则用 TE buffer补充至 40 μL

三、关于磁珠纯化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 转换文库推荐使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等双链 DNA 进行定量， 要求最终接头转换 PCR产物的摩尔产量至少为 1 pmol，可根据公式2计算或参考表2。

公式2 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表3  不同片段大小PCR产物1 pmol对应产量

2. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  
3. 单链环状 DNA 产物纯化后产量应达到 60 fmol 以上方足够一次上机测序的量，可根据公式3计算或参考表3 。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
60 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

表4  不同PCR产物片段大小对应60 fmol单链环产量

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控：Cat#12640，dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642，1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效产品。

3. 单链环质控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效产品。

3. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程

图1  通用文库转换流程

三、操作步骤

Part A接头转换PCR

1.转换PCR

该步骤对线性dsDNA文库进行转换-转化为可以进行后续环化的线性dsDNA文库。

将表5中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。

表5  转换PCR扩增反应体系

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表6所示反应程序，进行PCR扩增。

表6  PCR扩增反应程序

2、转换PCR产物纯化

1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads : DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：加入32 μL TE buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。

9. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移30 μL上清至干净的管中。

3、转换PCR产物质检

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等转换PCR产物进行定量，具体请参见注意事项四。

Part B 转换文库环化

1 变性

1. 根据文库长度，取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中，用 TE Buffer 补充至总体积 40 μL。

4. 混匀后，在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min，之后立即置于冰上，冰浴 2 min 后瞬时离心。

2 单链环化

1. 将表7中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表7反应体系。

表7  单链环化体系

3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表8所示摄制反应程序，进行单链环化反应。

表8  单链环化反应程序

3 酶切消化

1. 将表9中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表9所示反应体系。

表9 酶切消化体系

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表10的条件进行反应：

表10  酶切消化反应程序

5. 反应结束后，瞬时离心，立即进行纯化。

4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中，室温孵育10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约2 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置10 min。

9. 短暂离心，将 PCR 管始终置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 2min），将上清小心移至新 PCR 管中， -20℃保存，待制备 DNB。

5 消化产物质控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量，具体请参见注意事项四。

HB220117