Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI^®是针对 MGI^®高通量测序平台专门开发设计的单链环化试剂盒。本产品采用高质量的酶和经优化后的 buffer 组成，显著提高反应效率，使整个环化消化流程在 30 min 内完成。本试剂盒适用于所有连接华大标准接头的文库扩增产物， 除建库试剂本身的限制外，本环化试剂盒不限 MGI^®测序平台。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。所有组分-20°C保存，有效期1年。

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、样本要求及处理

2.1样本量要求

1. 本试剂盒推荐的Input DNA量为1 pmol；若PCR产物不足，最低可降至0.5 pmol投入量。

2. 若有特殊的环化投入量需求，则按照文库制备试剂盒的要求投入所需的 Input DNA 量。

3. 不同片段大小DNA 1 pmol 分子对应不同的质量，可根据公式 1 计算或参考表1选择所需的 Input DNA量：

公式 1 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表1  不同片段大小PCR产物1pmol对应产量

2.2 样本混样要求

1. Input DNA可以是单个样本，也可以是多个带有不同Barcodes的样本的混合物。

2. 对样本进行混合时需满足Barcodes混合的要求，可参考表Adapters试剂盒说明书选择合适的Barcodes进行混合。

3. 混合的样本总量推荐为1 pmol，若每个样本所需数据量相同，则等量混合，每个样本所需的质量按照公式2进行计算：

公式 2 混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量(ng)=1 pmol Input DNA对应的质量（ng）/混合的样本个数 N

4. 单个样本或混合后样本用于环化时，体积应为34 μL，若不足则用 ddH₂O补充至34 μL。

三、关于磁珠纯化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于–20°C可保存1个月。

四、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit^® ssDNA Assay Kit 单链DNA荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  

2. 针对华大智造高通量测序平台， 单链环产物纯化后产量应≥80 fmol（足够2次上机测序）。

3. 可根据公式3计算或参考表2。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算

80 fmol单链环对应的质量(ng)=0.08×DNA 主片段大小(bp)×0.33

表2  不同PCR产物片段大小对应80fmol单链环产量

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit^® ssDNA Assay Kit。

3. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程

图1  单链环化文库构建流程

三、操作步骤

3.1 变性

1. 根据文库长度，取1 pmol 至0.2 ml PCR管中，用ddH₂O补充至34 μL。

2. 将表3中试剂解冻后，颠倒混匀并置于冰上备用。

3. 于冰上配制表3反应体系。

表3  DNA变性体系

4. 混匀后，在PCR仪上进行98℃变性3 min，之后立即置于冰上，冰浴2 min 后瞬时离心。

3.2 单链环化

1. 将表4中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表4反应体系。

表4  单链环化体系

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表5所示设置反应程序，进行单链环化反应。

表5单链环化反应程序

3.3 酶切消化

1. 将表6中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表6所示反应体系。

表6  酶切消化体系

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表7的条件进行反应：

表7  酶切消化反应程序

5. 反应结束后，瞬时离心，立即进行纯化。

3.4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads至消化产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约2 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置10 min。

9. 短暂离心，将 PCR 管始终置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 2min），将上清小心移至新 PCR 管中。

★停止点：环化纯化产物，可置于-20℃储存一个月。

3.4 消化产物质控

使用Qubit^® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量，具体请参见注意事项四。

HB220426

Q：13341ES可以用于双端 Barcode文库的环化吗？

A：13341ES是用于单端Barcode文库环化的，如果文库是双端Barcode，可以使用13340ES对文库进行环化。

Hieff NGS® Ultima DNA Ligation Module是针对Illumina®与MGI®高通量测序平台文库构建专业设计的DNA连接模块，其中最大的亮点为本产品采用一款我公司自主研发的高效连接酶Fast T4 DNA ligase。本产品可在双链平末端DNA片段或双链3´-dA DNA片段的两端连接Illumina^®与MGI^®测序平台适用的DNA接头，具有连接效率高、简便、可实现自动化等优势。

本产品已与Hieff NGS® Ultima Endperp Mix（Cat#12605），2×Super Canace® II High-Fidelity Mix for Library Amplification（Cat#12621）共同用于DNA文库构建，通过Illumina®高通量平台测序验证其有效性。

本产品已与Hieff NGS® Ultima Endprep Mix（Cat#12605）、2×Ultima HF Amplification Mix for MGI®（Cat#13344）共同用于DNA文库构建，通过MGI®高通量平台测序验证其有效性。

本产品中提供的所有试剂组分，都经过严格的质量与功能验证，最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存，效期一年。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）本产品仅作科研用途！

使用方法
1. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表1 . 500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

2. 目前主流的合并法DNA建库试剂盒，其末端修复和加A处理后一般不纯化，直接进行接头连接。本试剂盒可与主流的商业化末端修复加A体系兼容，进行接头连接。反应体系请参考如下配制，涡旋瞬离后置于20℃，反应15分钟即可。

表2 . Adapter Ligation体系

【注】：*对于5×Fast Ligation Buffer，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时后离心使用。

**根据自身需求加入适量的接头。

【接头添加计算举例】：当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步，计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]；

Input DNA 摩尔数（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步，计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表2查询接头添加比例

根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数（50 pmol）÷接头浓度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

综上，接头可添加3.4 μL，加1.6 μL水补齐至5 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）

HB210810

Q: 12640-A 组分放在 4 度冻住了？

A: 该现象属于正常现象。12640 包含以下组分，其中 A 组分为荧光染料母液，含有DMSO，DMSO 低温易凝固，使得看上去A 管像被冻住一样，该现象其实并不是常规意义上的“结冰”冻住，所以不会影响其中荧光染料的性能。

Q: 产品成分只有两个标准品，制作标准曲线的时候需要对 standard 2 进行多梯度稀释吗？

A: 使用Qubit定量的时根据操作步骤两个标准品即可。如果使用酶标仪等，需要多个梯度制作标准曲线，可以使用 1×TE 对standard 2 进行梯度稀释。

Q: 用酶标仪代替Qubit检测，如何选择酶标板？波长如何设定？

A: 选择黑色的酶标板。波长：Ex=480 nm，Em=520 nm。

Q：标准品荧光值与之前使用的有差异？一般标准品的荧光值应该是多少呢？

A：标准品没有一个确定的荧光值，且不同的仪器之间可能都有差异。可多做几个复孔或者多做几个梯度，呈线性关系即可。

[1] Xiong J, Wang P, Shao WX, et al. Genome-wide mapping of N4-methylcytosine at single-base resolution by APOBEC3A-mediated deamination sequencing. Chem Sci. 2022;13(34):9960-9972. Published 2022 Aug 11. doi:10.1039/d2sc02446b(IF:9.969)