NADP/NADPH比率荧光检测试剂盒(红色荧光)

NADP/NADPH比率荧光检测试剂盒(红色荧光)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD,辅酶Ⅰ)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP,氧化型辅酶Ⅱ)是细胞中常见的重要辅因子,通过电子交换参与各种代谢反应。NAD与一个磷酸分子以酯键结合形成NADP,NADP作为氧化剂参与光合作用。还原性辅酶II (NADPH)是NADP接受电子后的产物。NADPH作为供氢体可参与体内多种代谢反应,如:脂肪酸和核酸的合成。

该试剂盒适用于测定NADP和NADPH,背景低,灵敏度高。NADPH可以将探针还原为高荧光产物,其信号可以通过荧光酶标仪在Ex/Em = 540/590 nm或在比色测定(OD =576 nm)中定量。

 

产品组分

组分编号

 组分名称

组分规格

储存条件

50140-A

NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix

2 vials

-20℃

50140-B

NADPH Sensor Buffer

20 mL×1

-20℃

50140-C

NADPH Standard

1 vial (167 µg)

-20℃

50140D

NADPH Extraction Solution  

10 m1

-20℃

50140E

NADP Extraction Solution

10 m1

-20℃

50140-F

NADP/NADPH Control Solution

10 m1

-20℃

50140-G

NADP/NADPH Lysis Buffer

10 m1

-20℃

 

运输和保存方法

冰袋运输。避光保存于-20℃,有效期1

 

注意事项

1 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭

2 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前请先短暂离心,以保证产品全在管底。

4 请勿吸入、吞咽或者直接接触皮肤和眼睛。

5 本产品仅用于科研用途。

 

实验过程

1 试剂准备

NADPH标准品母液(1 mM):将200 μL PBS (pH 7.4)加入NADPH StandardC组分)中制备1 mM NADPH标准品母液,用时置于冰上,未用完的分装-20°C保存,避免反复冻融。

NADPH梯度标准液(0-10 μM):将990 μL PBS (pH 7.4)加入到10 μL NADH标准母液(1 mM)中制备10 μM NADPH标准液,然后取200 μL的10 μM NADPH标准液按照1:3的比例用PBS (pH 7.4)稀释成NADPH梯度标准液(3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.041 μM, 0.014 μM)。

【注】:稀释后的NADPH标准液不稳定,应该配置后4 h内使用

NADP/NADPH反应液:向每瓶NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix(组分A)中加入10 mL NADPH Sensor Buffer(B组分),混匀。

【注】:相当于125次测试的检测用量,请根据实际情况进行调整NADP/NADPH反应液在室温下不稳定,注意避光尽快使用。

NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G):用前恢复至室温。

2 样本制备

2.1 细胞样本:收集0.5-1×107个细胞,预冷PBS润洗后,加入100 μL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),37°C孵育15 min,1500 rpm室温离心5 min,取上清检测。

2.2 组织样本:取20 mg组织样本,预冷PBS润洗后,加入400 μL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),室温匀浆,2500 rpm室温离心5 -10 min,取上清检测。

2.3 细菌样本:4°C 10,000 g离心15 min收集细菌,每107个细菌加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),室温孵育15 min,2500 rpm室温离心5 -10 min,取上清检测。

2.4 植物样本:取200 mg叶片,加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),室温匀浆,2500 rpm室温离心5 -10 min,取上清检测。

【注】:建议使用新鲜样本,如果无法及时进行检测,样本建议存于-80 °C,检测时冰上解冻,但是检测的荧光值可能会降低。不要使用RIPA裂解液,因为RIPA裂解液会干扰检测。如果样本中NADPH含量高,注意稀释样本。

3 检测过程

3.1 如下图,向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADPH标准液、待测样本或空白对照(PBS)。

Table 1. Layout of NADPH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

BL

BL

TS (Total)

TS (Total)

TS (NADPH)

TS (NADPH)

TS (NADP)

TS (NADP)

NS1

NS1

 

 

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

 

 

 

 

NS4

NS4

 

 

 

 

 

 

NS5

NS5

 

 

 

 

 

 

NS6

NS6

 

 

 

 

 

 

NS7

NS7

 

 

 

 

 

 

NS= NADPH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated withNADP/NADPH Control Solution , TS (NADPH) = test sample treated with NADPH Extraction Solution, then neutralized by NADP Extraction, TS (NADP) = test sample treated with NADP Extraction Solution , then neutralized by NADPH Extraction Solution

3.2 对于NADPH提取向待测样本中加入25 μL NADPH Extraction Solution(组分D),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADP Extraction Solution(组分E)中和。

3.3 对于NADP提取向待测样本中加入25 μL NADP Extraction Solution(组分E),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADPH Extraction Solution(组分D)中和。

3.4 对于总NADP和NADPH:向待测样本中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F)。

3.5 对于NADH标准液NS1-7:向NADPH标准液中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F)。

Table 2 Reagent composition for each well

Well

Reagent

Treatment

Incubate at RT 10-15 min

Treatment

Total Volume

NS1-7

25 μL NADPH Standard (0-10 μM NADPH)

25 μL F

25 μL F

75 μL

BL

25 μL PBS (pH 7.4)

25 μL F

25 μL F

75 μL

TS (Total)

25 μL Test sanmple

25 μL F

25 μL F

75 μL

TS (NADPH)

25 μL Test sanmple

25 μL D

25 μL E

75 μL

TS (NADP)

25 μL Test sanmple

25 μL E

25 μL D

75 μL

3.6 每孔中加入75 μL NADP/NADPH反应液(测试总体积150 μL),混匀后,室温避光孵育15 min-2 h。

3.7 荧光酶标仪下测量荧光读值(Ex/Em = 540/590 nm);也可以使用白色透明96孔板,使用酶标仪在OD=576±5nm的波长下读数,但灵敏度低于荧光检测。

【注】:高浓度的NADPH(终浓度>100 μM)会导致荧光读值下降,因为NADPH sensor被过度氧化,生成非荧光产物。

 

数据分析

1 从空白标准孔获得的读数用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值,以获得基线校正值,荧光背景会随时间而增加,因此标准品和测试样本的荧光读值计算前需减去空白孔的荧光强度值。然后,通过绘制标准读数以获得标准曲线和方程。

NADP/NADPH比率荧光检测试剂盒(红色荧光)

1 NADPH标准曲线

加入75 μL NADP/NADPH反应液后室温避光孵育30 min后,荧光酶标仪下测量荧光读值。

2 样本中NADPH含量计算公式:NADPH concentration = (B/V)×D。B代表根据标曲计算出的测试样本中NADPH的含量(μM),V代表测试样本体积(μL),D代表测试样本稀释倍数。

3 样本中总NADP和NADPH含量计算公式:Total concentration = (B/V)×D。B代表根据标曲计算出的测试样本中总的NADP和NADPH的含量(μM),V代表测试样本体积(μL),D代表测试样本稀释倍数。

4 使用总NADP和NADPH含量减去NADPH来计算NADP的量。

HB221230

NADP/NADPH比率荧光检测试剂盒(红色荧光)

暂无内容

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暂无内容

 

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD,辅酶Ⅰ)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP,氧化型辅酶Ⅱ)是细胞中常见的重要辅因子,通过电子交换参与各种代谢反应。NAD与一个磷酸分子以酯键结合形成NADP,NADP作为氧化剂参与光合作用。还原性辅酶II (NADPH)是NADP接受电子后的产物。NADPH作为供氢体可参与体内多种代谢反应,如:脂肪酸和核酸的合成。

该试剂盒适用于测定NADP和NADPH,背景低,灵敏度高。NADPH可以将探针还原为高荧光产物,其信号可以通过荧光酶标仪在Ex/Em = 540/590 nm或在比色测定(OD =576 nm)中定量。

 

产品组分

组分编号

 组分名称

组分规格

储存条件

50140-A

NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix

2 vials

-20℃

50140-B

NADPH Sensor Buffer

20 mL×1

-20℃

50140-C

NADPH Standard

1 vial (167 µg)

-20℃

50140D

NADPH Extraction Solution  

10 m1

-20℃

50140E

NADP Extraction Solution

10 m1

-20℃

50140-F

NADP/NADPH Control Solution

10 m1

-20℃

50140-G

NADP/NADPH Lysis Buffer

10 m1

-20℃

 

运输和保存方法

冰袋运输。避光保存于-20℃,有效期1

 

注意事项

1 荧光染料均存在淬灭问题,请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭

2 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

3 粉末溶解前请先短暂离心,以保证产品全在管底。

4 请勿吸入、吞咽或者直接接触皮肤和眼睛。

5 本产品仅用于科研用途。

 

实验过程

1 试剂准备

NADPH标准品母液(1 mM):将200 μL PBS (pH 7.4)加入NADPH StandardC组分)中制备1 mM NADPH标准品母液,用时置于冰上,未用完的分装-20°C保存,避免反复冻融。

NADPH梯度标准液(0-10 μM):将990 μL PBS (pH 7.4)加入到10 μL NADH标准母液(1 mM)中制备10 μM NADPH标准液,然后取200 μL的10 μM NADPH标准液按照1:3的比例用PBS (pH 7.4)稀释成NADPH梯度标准液(3.33 μM, 1.11 μM, 0.37 μM, 0.123 μM, 0.041 μM, 0.014 μM)。

【注】:稀释后的NADPH标准液不稳定,应该配置后4 h内使用

NADP/NADPH反应液:向每瓶NADP/NADPH Recycling Enzyme Mix(组分A)中加入10 mL NADPH Sensor Buffer(B组分),混匀。

【注】:相当于125次测试的检测用量,请根据实际情况进行调整NADP/NADPH反应液在室温下不稳定,注意避光尽快使用。

NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G):用前恢复至室温。

2 样本制备

2.1 细胞样本:收集0.5-1×107个细胞,预冷PBS润洗后,加入100 μL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),37°C孵育15 min,1500 rpm室温离心5 min,取上清检测。

2.2 组织样本:取20 mg组织样本,预冷PBS润洗后,加入400 μL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),室温匀浆,2500 rpm室温离心5 -10 min,取上清检测。

2.3 细菌样本:4°C 10,000 g离心15 min收集细菌,每107个细菌加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),室温孵育15 min,2500 rpm室温离心5 -10 min,取上清检测。

2.4 植物样本:取200 mg叶片,加入1 mL NADP/NADPH Lysis Buffer(组分G),室温匀浆,2500 rpm室温离心5 -10 min,取上清检测。

【注】:建议使用新鲜样本,如果无法及时进行检测,样本建议存于-80 °C,检测时冰上解冻,但是检测的荧光值可能会降低。不要使用RIPA裂解液,因为RIPA裂解液会干扰检测。如果样本中NADPH含量高,注意稀释样本。

3 检测过程

3.1 如下图,向96孔黑色平底孔板中加入25 μL的NADPH标准液、待测样本或空白对照(PBS)。

Table 1. Layout of NADPH standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

BL

BL

TS (Total)

TS (Total)

TS (NADPH)

TS (NADPH)

TS (NADP)

TS (NADP)

NS1

NS1

 

 

NS2

NS2

 

 

NS3

NS3

 

 

 

 

 

 

NS4

NS4

 

 

 

 

 

 

NS5

NS5

 

 

 

 

 

 

NS6

NS6

 

 

 

 

 

 

NS7

NS7

 

 

 

 

 

 

NS= NADPH Standard, BL = Blank Control, TS (Total) = Test Sample treated withNADP/NADPH Control Solution , TS (NADPH) = test sample treated with NADPH Extraction Solution, then neutralized by NADP Extraction, TS (NADP) = test sample treated with NADP Extraction Solution , then neutralized by NADPH Extraction Solution

3.2 对于NADPH提取向待测样本中加入25 μL NADPH Extraction Solution(组分D),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADP Extraction Solution(组分E)中和。

3.3 对于NADP提取向待测样本中加入25 μL NADP Extraction Solution(组分E),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADPH Extraction Solution(组分D)中和。

3.4 对于总NADP和NADPH:向待测样本中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F)。

3.5 对于NADH标准液NS1-7:向NADPH标准液中加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F),室温孵育10-15 min,再加入25 μL NADP/NADPH Control Solution(组分F)。

Table 2 Reagent composition for each well

Well

Reagent

Treatment

Incubate at RT 10-15 min

Treatment

Total Volume

NS1-7

25 μL NADPH Standard (0-10 μM NADPH)

25 μL F

25 μL F

75 μL

BL

25 μL PBS (pH 7.4)

25 μL F

25 μL F

75 μL

TS (Total)

25 μL Test sanmple

25 μL F

25 μL F

75 μL

TS (NADPH)

25 μL Test sanmple

25 μL D

25 μL E

75 μL

TS (NADP)

25 μL Test sanmple

25 μL E

25 μL D

75 μL

3.6 每孔中加入75 μL NADP/NADPH反应液(测试总体积150 μL),混匀后,室温避光孵育15 min-2 h。

3.7 荧光酶标仪下测量荧光读值(Ex/Em = 540/590 nm);也可以使用白色透明96孔板,使用酶标仪在OD=576±5nm的波长下读数,但灵敏度低于荧光检测。

【注】:高浓度的NADPH(终浓度>100 μM)会导致荧光读值下降,因为NADPH sensor被过度氧化,生成非荧光产物。

 

数据分析

1 从空白标准孔获得的读数用作阴性对照。从其他标准的读数中减去该值,以获得基线校正值,荧光背景会随时间而增加,因此标准品和测试样本的荧光读值计算前需减去空白孔的荧光强度值。然后,通过绘制标准读数以获得标准曲线和方程。

NADP/NADPH比率荧光检测试剂盒(红色荧光)

1 NADPH标准曲线

加入75 μL NADP/NADPH反应液后室温避光孵育30 min后,荧光酶标仪下测量荧光读值。

2 样本中NADPH含量计算公式:NADPH concentration = (B/V)×D。B代表根据标曲计算出的测试样本中NADPH的含量(μM),V代表测试样本体积(μL),D代表测试样本稀释倍数。

3 样本中总NADP和NADPH含量计算公式:Total concentration = (B/V)×D。B代表根据标曲计算出的测试样本中总的NADP和NADPH的含量(μM),V代表测试样本体积(μL),D代表测试样本稀释倍数。

4 使用总NADP和NADPH含量减去NADPH来计算NADP的量。

HB221230

NADP/NADPH比率荧光检测试剂盒(红色荧光)

暂无内容

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暂无内容

NADP•Na2氧化型辅酶II二钠 核苷酸类辅酶|β-NADP·Na2|CAS 24292-60-2

NADP•Na2氧化型辅酶II二钠 核苷酸类辅酶|β-NADP·Na2|CAS 24292-60-2

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

NADP·Na2氧化型辅酶II钠,为常见的β-NADP·Na2(β-Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, oxidized form, disodium salt),亦称为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠,是氧化型辅酶II的钠盐形式。它是一种极为重要的核苷酸类辅酶,是烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2’-位的磷酸化衍生物,普遍存在生物界内。植物体内NADPH产自光合作用光反应电子链的最后一步,此步以NADP+为原料,经铁氧还蛋白-NADP+还原酶催化而成。产生的NADPH在接下来的碳反应(暗反应)中被用于二氧化碳的同化。对于动物和其他非光合有机体来说,NADPH主要来自磷酸戊糖途径。

NADPH作为NADP+的还原形式,用作还原剂,氢负供体,参与生物合成和氧化还原反应以保护机体免受活性氧(ROS)损伤,促使还原性谷胱甘肽GSH的再生。NADPH还参与多种合成代谢反应,如脂类和胆固醇的合成,以及脂肪酸链延伸。免疫细胞中NADPH还能参与自由基的生成,这些自由基能够破坏引起氧爆发的病原体。

产品性质

结构式(Structure) NADP•Na2氧化型辅酶II二钠 核苷酸类辅酶|β-NADP·Na2|CAS 24292-60-2
中文别名(Chinese Synonym) 氧化型辅酶Ⅱ二钠,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠
英文别名(English Synonym) β-NAHP+ or β-Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,oxidized form,disodium

CAS号(CAS NO.)

24292-60-2

纯度(Purity)

≥95%(HPLC)

含水量(Water Contents)

≤8%

外观(Appearance)

白色至黄色粉末

分子式(Formula)

C21H26N7Na2O17P3

分子量(Molecular Weight)

787.37

溶解性(Solubility)

溶于水,溶解度可达200 mg/mL。

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存,有效期2年。

注意事项

1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)本产品仅作科研用途!

相关产品推荐

产品名称

产品编号

规格

NADH-Na2 还原型辅酶Ⅰ二钠

60301JP03/08/25/60

1g/5g/25g/100g

NADPH-Na4 还原型辅酶Ⅱ四钠

60302JP01/02/03/08

100mg/500mg/1g/5g

β-Nicotinamide mononucleotide (β-NMN) β-烟酰胺单核苷酸

60303JP25/60/76/80

25mg/100mg/500mg/1g

NAD氧化型辅酶I

60323JP08/25/60/76

5g/25g/100g/500g

NADP·Na2氧化型辅酶II二钠

60324JP03/08/25/60

1g/5g/25g/100g

 

HB181221

 

 

NADP•Na2氧化型辅酶II二钠 核苷酸类辅酶|β-NADP·Na2|CAS 24292-60-2

暂无内容

[1] Zou Y, Wang A, Huang L, et al. Illuminating NAD+ Metabolism in Live Cells and In Vivo Using a Genetically Encoded Fluorescent Sensor. Dev Cell. 2020;53(2):240-252.e7. doi:10.1016/j.devcel.2020.02.017(IF:10.092)
[2] Zhang B, Sun J, Zheng Y, Mao X, Lin J, Wei D. Identification of a novel ene reductase from Pichia angusta with potential application in (R)-levodione production. RSC Adv. 2022;12(22):13924-13931. Published 2022 May 10. doi:10.1039/d2ra01716d(IF:3.361)

 

NADP·Na2氧化型辅酶II钠,为常见的β-NADP·Na2(β-Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, oxidized form, disodium salt),亦称为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠,是氧化型辅酶II的钠盐形式。它是一种极为重要的核苷酸类辅酶,是烟酸酰胺腺嘌呤二核苷酸(β-NAD+)中与腺嘌呤相连的核糖环系2’-位的磷酸化衍生物,普遍存在生物界内。植物体内NADPH产自光合作用光反应电子链的最后一步,此步以NADP+为原料,经铁氧还蛋白-NADP+还原酶催化而成。产生的NADPH在接下来的碳反应(暗反应)中被用于二氧化碳的同化。对于动物和其他非光合有机体来说,NADPH主要来自磷酸戊糖途径。

NADPH作为NADP+的还原形式,用作还原剂,氢负供体,参与生物合成和氧化还原反应以保护机体免受活性氧(ROS)损伤,促使还原性谷胱甘肽GSH的再生。NADPH还参与多种合成代谢反应,如脂类和胆固醇的合成,以及脂肪酸链延伸。免疫细胞中NADPH还能参与自由基的生成,这些自由基能够破坏引起氧爆发的病原体。

产品性质

结构式(Structure) NADP•Na2氧化型辅酶II二钠 核苷酸类辅酶|β-NADP·Na2|CAS 24292-60-2
中文别名(Chinese Synonym) 氧化型辅酶Ⅱ二钠,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠
英文别名(English Synonym) β-NAHP+ or β-Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate,oxidized form,disodium

CAS号(CAS NO.)

24292-60-2

纯度(Purity)

≥95%(HPLC)

含水量(Water Contents)

≤8%

外观(Appearance)

白色至黄色粉末

分子式(Formula)

C21H26N7Na2O17P3

分子量(Molecular Weight)

787.37

溶解性(Solubility)

溶于水,溶解度可达200 mg/mL。

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存,有效期2年。

注意事项

1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2)本产品仅作科研用途!

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产品名称

产品编号

规格

NADH-Na2 还原型辅酶Ⅰ二钠

60301JP03/08/25/60

1g/5g/25g/100g

NADPH-Na4 还原型辅酶Ⅱ四钠

60302JP01/02/03/08

100mg/500mg/1g/5g

β-Nicotinamide mononucleotide (β-NMN) β-烟酰胺单核苷酸

60303JP25/60/76/80

25mg/100mg/500mg/1g

NAD氧化型辅酶I

60323JP08/25/60/76

5g/25g/100g/500g

NADP·Na2氧化型辅酶II二钠

60324JP03/08/25/60

1g/5g/25g/100g

 

HB181221

 

 

NADP•Na2氧化型辅酶II二钠 核苷酸类辅酶|β-NADP·Na2|CAS 24292-60-2

暂无内容

[1] Zou Y, Wang A, Huang L, et al. Illuminating NAD+ Metabolism in Live Cells and In Vivo Using a Genetically Encoded Fluorescent Sensor. Dev Cell. 2020;53(2):240-252.e7. doi:10.1016/j.devcel.2020.02.017(IF:10.092)
[2] Zhang B, Sun J, Zheng Y, Mao X, Lin J, Wei D. Identification of a novel ene reductase from Pichia angusta with potential application in (R)-levodione production. RSC Adv. 2022;12(22):13924-13931. Published 2022 May 10. doi:10.1039/d2ra01716d(IF:3.361)