| Transgene |
Organism |
Tissue |
Morphology |
Culture Properties |
| mCherry-p65 |
Mus musculus (Mouse) |
Embryo |
Fibroblast |
Adherent |
mCherry-p65 NIH/3T3 Cells，即mCherry-p65 NIH/3T3细胞，是一种可以通过CMV启动子组成型表达mCherry-p65融合蛋白的多克隆NIH/3T3稳定细胞株(Polyclonal NIH/3T3 stable cell line)，主要适合用于通过荧光显微镜等观察和分析NF-κB中的p65亚基的细胞内定位，从而确定pNF-κB信号通路的激活和抑制。本细胞株带有通过EF1α启动子表达的嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选基因，建议使用2μg/ml Puromycin (ST551)维持稳定细胞株中相应基因的表达。
NF-κB (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，中文名为激活的B细胞核因子kappa-轻链增强子，是细胞内重要的核转录因子，参与细胞对外界刺激的响应、炎症反应、免疫应答等过程，几乎存在于所有类型的动物细胞中。NF-κΒ作为转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (REL-associated protein, Rel-A)、Rel-B和c-Rel，它们的N端都具有高度保守的RHD (REL homology domain)；5个亚单位根据C端结构域的不同被分为两类，第一类为p50、p52，其C端具有ankyrin重复结构域具有转录抑制活性(Transrepression activity)和招募IKK (Inhibitory κB kinase)的致死结构域(Dead domain)；第二类为p65、Rel-B和c-Rel，其C端具有转录所必需的转录激活结构域(Transactivation domain, TAD) [1]。
NF-κB在静息状态或失活状态(Resting state or inactive state)下，其高度保守的RHD中的核定位信号(Nuclear localization sequence, NLS)与抑制因子IκB (Inhibitor of NF-κB)结合形成非活性复合物，NF-κB以失活状态存在于细胞质中。虽然IκB蛋白掩盖了p65的NLS信号，但没有掩盖p50的NLS信号，因此静息状态下NF-κB可以持续在细胞核和细胞质之间穿梭(Shuttle)维持很低水平的活性[2]。
NF-κB的激活存在两条途径，即经典途径和非经典途径。经典途径：在促炎信号(如炎症细胞因子TNF-α、IL-1、病原体和病毒双链RNA等)刺激后，使细胞中的IKK复合物被招募并激活，IKK复合物由IKKα和/或IKKβ催化亚基以和NEMO (NF-κB essential modulator，亦称IKKγ)组成，IKK复合物使IκB被磷酸化，磷酸化的IκB随后发生泛素化被蛋白酶体降解，使得NF-κB的核定位信号暴露从而进入细胞核激活靶基因；非经典途径：该途径由NF-κB抑制激酶NIK (NF-κB inhibitory kinase)介导，NIK磷酸化并激活IKK的亚基IKKα，磷酸化的IKKα再使p100磷酸化，导致加工和释放有活性的p52和RelB异源二聚体转移至细胞核并激活靶标基因，这一过程发生在淋巴器官发育期间，淋巴器官负责产生B淋巴细胞和T淋巴细胞[2]。
本细胞株通过荧光显微镜观察，静息状态下mCherry-p65均匀分布在细胞质中，NF-κB被激活后mCherry-p65向细胞核内转移，效果如图1所示。需要注意的是，通常情况下终浓度为20ng/ml的TNF-α (P5320)能够有效刺激mCherry-p65进入细胞核，但随着时间的延长mCherry-p65会出核并再次回到细胞质中，因此加入TNF-α后观察mCherry-p65进入细胞核理想的时间为15-60分钟之间(图1, 第2行)；为方便观察mCherry-p65的核转运所代表的NF-κB信号通路的激活，可以加入终浓度为5nM的Leptomycin B (S1726), Leptomycin B是一种不饱和支链脂肪酸，可以通透细胞，抑制细胞核向细胞浆的蛋白转运，在不影响mCherry-p65进入细胞核的前提下(图1, 第3行)，可以延长TNF-α有效刺激mCherry-p65进入细胞核的滞留时间(图1, 第4行)。
图1. 碧云天mCherry-p65 NIH/3T3 Cells (C8010)经TNF-α激活NF-κB信号通路诱导核转运的效果图。稳定表达mCherry-p65的NIH/3T3细胞，加入或不加入终浓度为20ng/ml的TNF-α (P5320)和5nM的Leptomycin B (S1726)，分别在0、30、60和120分钟用荧光显微镜进行拍照。可见在静息状态(Inactive state)下，mCherry-p65均匀分布在细胞质中(第1行)；加入TNF-α刺激后，激活状态(Active state)下mCherry-p65进入细胞核内(第2行，30分钟)，但是随着时间的延长mCherry-p65会出核再次回到细胞质中(第2行，120分钟)；终浓度为5nM的Leptomycin B不会导致mCherry-p65进入细胞核(第3行)，用Leptomycin B和TNF-α一起处理细胞可以延长mCherry-p65进入细胞核的滞留时间，方便观察NF-κB的核转运(第4行)。实际效果会因实验仪器、检测条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。
本细胞株详细信息如下:
| General Information |
| Cell Line Name |
mCherry-p65 NIH/3T3 Cells |
| Transgene |
CMV-mCherry-p65-EF1α-Puro |
| Synonyms |
/ |
| Organism |
Mus musculus(Mouse) |
| Tissue |
Embryo |
| Cell Type |
Polyclonal Stable Cell Line |
| Morphology |
Fibroblast |
| Disease |
－ |
| Strain |
NIH/Swiss |
| Biosafety Level* |
1 |
| Age at Sampling |
Embryo |
| Gender |
Male |
| Genetics |
Whole embryo |
| Ethnicity |
－ |
| Applications |
Stable cell lines with specific gene over-expression or knock-down are very helpful in gene function analysis, target discovery, target validation, assay development, and compound screening. |
| Category |
－ |
* Biosafety classification is based on U.S. Public Health Service Guidelines, it is the responsibility of the customer to ensure that their facilities comply with biosafety regulations for their own country.
| Characteristics |
| Karyotype |
－ |
| Virus Susceptibility |
Murine leukemia virus |
| Derivation |
－ |
| Clinical Data |
－ |
| Antigen Expression |
－ |
| Receptor Expression |
－ |
| Oncogene |
－ |
| Genes Expressed |
－ |
| Gene expression databases |
GEO: GSM1014177 |
| Metastasis |
－ |
| Tumorigenic |
－ |
| Effects |
－ |
| Comments |
Tested and found negative for ectromelia virus (mousepox). |
| Culture Method |
| Doubling Time |
~20 hrs |
| Methods for Passages |
Wash by PBS once then 0.05% trypsin-EDTA solution and incubate at room temperature (or at 37℃), observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 1 to 5 minutes) |
| Medium |
90% DMEM (high glucose) + 10% FBS + 2μg/ml Puromycin |
| Special Remarks |
－ |
| Medium Renewal |
Twice per week.DO NOT ALLOW THE CELLS TO BECOME CONFLUENT. |
| Subcultivation Ratio |
3~5×103 cells/cm2 |
| Growth Condition |
95% air + 5% CO2, 37℃ |
| Freeze medium |
DMEM (high glucose) + 20% FBS + 10% DMSO，也可以订购碧云天的细胞冻存液(C0210)。 |
本细胞株经过支原体检测(Mycoplasma Test)，检测结果为阴性。
包装清单：
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| C8010 |
mCherry-p65 NIH/3T3 Cells |
1支/瓶 |
| — |
说明书 |
1份 |
保存条件：
对于细胞培养瓶或离心管运输的活细胞，室温3-5天有效。对于干冰运输的冻存细胞，液氮保存，长期有效；-80℃保存，2个月有效。
注意事项：
本细胞株未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。使用者在发表研究论文或结果时，应注明细胞株的来源。
本细胞株相关资料参考ATCC (American Type Culture Collection)、DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)、JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)、Cellosaurus (Swiss Institute of Bioinformatics)等网站信息，并结合碧云天实际培养信息综合而成。由于细胞培养的条件、代数等因素，实际细胞可能与本说明书提供的信息有一定的差异，具体以实际细胞为准。
STR结果可以与ATCC、DSMZ及中国国家实验细胞资源共享平台等网站的数据库进行比对，匹配度80%以上即可认为该细胞系正确。
本产品会根据细胞是否正在培养、目的地距离等因素确定运输方式：冷冻的细胞冻存管(干冰)、一小瓶贴壁培养的细胞或一小瓶/管悬浮培养的细胞(常温)。为了更好地耐受长途运输和环境温度等变化，对于正常贴壁培养的细胞，也可能会以悬浮的形式培养在细胞培养瓶或离心管中进行运输。
对于干冰运输的冻存细胞，若干冰已经完全融化，请立即将细胞复苏培养，切勿再次低温冻存；若尚留有干冰，请直接复苏培养或立即将含有细胞的冻存管放入液氮中保存待用，切不可将细胞置于高温环境。
收到冻存的细胞后请尽快复苏细胞进行培养，以确认细胞活力、状态并保种。如暂时不进行复苏操作，冻存细胞可在-80℃条件下保存2个月。
每支冻存管约含1×106个细胞，体积为0.5-1ml，预期存活率60-90%，建议复苏至1个6cm培养皿中。如果复苏后存活率较低，可以消化后转移至3.5cm培养皿中，这样细胞生长会更好。
如果本产品是常温运输，并且是培养瓶中充满完全培养液的贴壁细胞，收到细胞后请在显微镜下观察细胞生长状态，如果细胞密度超过85%请尽快进行传代操作；如果悬浮的细胞较多，请将培养瓶置于培养箱中静置过夜以使悬浮的细胞再次贴壁。如果收到的是常温运输的离心管装的悬浮细胞，可以直接取出转移至培养皿或培养瓶中培养。若培养液颜色正常则保留培养液继续培养，并且在首次更换培养液时，保留一半原培养液，并加入一半新鲜培养液，这样可以尽量避免由于培养液或血清差异导致细胞生长的不适应，确保细胞良好的生长状态。
细胞培养请在生物安全柜台中进行操作，并严格遵守无菌操作。
请在培养液中加入适量青霉素-链霉素溶液以防止可能的细菌污染，如碧云天的青霉素-链霉素溶液(100X) (C0222)。
理论上永生化细胞可无限传代，但为了保证细胞的良好状态，建议最早培养的几代细胞就冻存一批，并每培养一段时间后复苏早期冻存的细胞进行培养。
接收、处理、保存、丢弃及使用细胞的时候要遵守相关法律法规，充分考虑可能存在的风险和责任，采取适当的安全和处理措施尽量降低对健康或环境的危害。
本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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