Hieff NGS^® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)利用RNase H消化法去除人、小鼠和大鼠来源总RNA中的核糖体RNA和45S ITS/ETS区域以保留信使RNA (mRNA)和其它非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果。由于降解的FFPE样本相比新鲜组织样本通常含有较高比例的ITS/ETS，该试剂盒人、小鼠和大鼠45S ITS/ETS区域的探针，经该试剂盒去除后可显著提高测序结果中有效数据比例。

适用范围
适用于人、小鼠和大鼠来源的100 ng~1 μg总RNA样品；适用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）样品。

产品组分

组分编号和名称			12257ES24	12257ES96
12257-A		Hybridization Buffer	72 μL	288 μL
12257-B		Human Probe Mix (rRNA & ITS/ETS)	48 μL	192 μL
12257-C		RNase H Buffer	72 μL	288 μL
12257-D		RNase H	48 μL	192 μL
12257-E		DNase I Buffer	660 μL	2×1320 μL
12257-F		DNase I	60 μL	240 μL

运输与保存方法
干冰运输，-20 °C存放。有效期1年。

注意事项

1. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM 高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

2. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

3. RNA样品最大投入体积为10 μL，若样品体积较大，可先进行浓缩。
4. RNase H 消化步骤如需配Mix使用，请现配现用。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

6. 本产品仅作科研用途！

自备材料

1. RNA纯化磁珠：Hieff NGS^® Cleaner (Cat#12602)或其他等效产品。

2. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) (Cat#11201)或其他等效产品。

3. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

操作步骤

1. 探针杂交
 

1.1 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H₂O稀释至10 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表1 探针杂交反应体系

1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。

表2 探针杂交反应程序

2. RNase H消化
 

2.1 将RNase H消化试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表 3 所示，配制RNase H消化反应体系。

表3 RNase H消化反应体系

注：RNase H Buffer及RNase H需单独添加，若因样本量较多需配置mix，请现配现用，否则会影响去除效果。

2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

2.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50 °C；37 °C，30 min； 4 °C，hold，进行RNase H消化反应。

3. DNase I 消化
 

3.1 将DNase I消化试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表4所示，配制DNase I消化反应体系。

表4 DNase I消化反应体系

3.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：热盖50 °C；37 °C，30 min；4 °C，hold，进行DNase I消化反应。

4. RNA纯化
 

4.1 准备工作：将Hieff NGS^® RNA Cleaner (Cat#12602)磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease free H₂O配制 80%乙醇。

4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

4.3 吸取110 μL Hieff NGS^® RNA Cleaner (2.2×，Beads:DNA=2.2:1)至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。

4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

4.7 保持PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠 (5~10 min)。

4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H₂O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H₂O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。

4.9 将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取10 μL上清（可根据步骤4.7选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】：洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80 °C存放。

案例展示
不同Human RNA样本分别不含ITS/ETS去除rRNA、使用含ITS/ETS的Cat#12257去除rRNA及ITS/ETS后衔接RNA建库试剂盒进行文库构建，经测序分析rRNA与ITS/ETS在下机数据中的占比。

表：不同RNA质量样本使用含或者不含ITS/ETS探针的测试数据展示

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Q：12257去除rRNA有残留？

A：（1）RNase H Buf&RNase H混Mix放置稳定性较差，建议RNase H消化步骤单加或配Mix现配现用（配置好后10min内用完）；（2）混匀不彻底导致rRNA残留，建议使用振荡器“隔手轻振”的方式混匀样品。

Q：RNaseH单酶稳定性如何？4℃放置会影响rRNA去除效果吗？

A：RNaseH单酶稳定性良好，翌圣测试4℃放置11天rRNA去除效果仍然正常。

[1]Liu Y, Han R, Zhou L, et al. Comparative performance of the GenoLab M and NovaSeq 6000 sequencing platforms for transcriptome and LncRNA analysis [published correction appears in BMC Genomics. 2022 Jan 26;23(1):81]. BMC Genomics. 2021;22(1):829. Published 2021 Nov 17. doi:10.1186/s12864-021-08150-8(IF:4.547)

[2]Li M, Guo D, Chen X, Lu X, Huang X, Wu Y. Transcriptome profiling and co-expression network analysis of lncRNAs and mRNAs in colorectal cancer by RNA sequencing. BMC Cancer. 2022;22(1):780. Published 2022 Jul 16. doi:10.1186/s12885-022-09878-6(IF:4.638)