Product # LT-KDMB-A1 Ludger Document # LT-KDMB-A1-Guide-v6.3
LudgerTagTM DMB 唾液酸放行和贴标试剂盒产品指南
Ludger LT-KDMB-A1说明书
LT-KDMB-A1 的质量标准
LT-KDMB-A1
应用 用于从糖蛋白中释放唾液酸，并用 1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基苯标记。2HCl (DMB)。
染料性质 相对分子量 = 225.07 gmol-1
荧光，λex = 373 nm，λem = 448 nm。
结构
别名 DMB；1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基苯2盐酸盐；1,3-苯并二氧杂-5,6-二胺2盐酸盐；5,6-二氨基-1,3-苯并二氧杂
性状 该试剂盒包含用于从糖蛋白中释放唾液酸的试剂。释放的唾液酸通过胺化环化反应与 DMB 染料结合。
样本数量试剂盒包含多达 22 个样本的试剂和材料，包括唾液酸参比组、N-乙酰神经氨酸和 N-羟乙酰神经氨酸定量标准品。
样品量 每次分析通常从 50-200µg 糖蛋白开始。我们建议一式三份分析样本。
合适的样本 糖蛋白、糖肽或聚糖释放的任何唾液酸均可被标记。
储存： Store at -18 ℃ 下避光储存。避免热源、光和湿气。供应的试剂可稳定储存至少两年。
运输： 产品可在环境温度下运输。
处理： 确保使用的任何玻璃、塑料器具或溶剂不含糖苷酶和环境碳水化合物。所有样本处理程序均应佩戴无粉手套，避免环境碳水化合物污染。
单个小瓶试剂开封后，应立即使用其内容物。根据当地安全规则丢弃任何多余部分。
安全性： 仅供研究使用。不适用于人类或药物
请阅读所有所用化学品的安全数据表 (SDS)。涉及标记试剂的所有过程均应使用适当的个人安全防护 – 眼镜、耐化学腐蚀手套（如丁腈），并在适当的实验室通风橱中进行。
套件内容物
每个试剂盒包含以下各一瓶：
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目录号编号 |
项目 |
数量 |
|
LT-DMB-01 |
DMB 染料 |
0.7 mg |
|
LT-ACETIC2M-01 |
2 摩尔醋酸 |
2 x 1.1 mL |
|
LT-MERCAPTO-01 |
乙酸中的巯基乙醇（1.4 摩尔） |
500 µL |
|
LT-DITHIO-01 |
连二亚硫酸钠（还原剂） |
4 mg |
|
CM-NEUAC-01 |
N-乙酰神经氨酸定量标准品 |
1 nmol |
|
CM-NEUGC-01 |
N-羟乙酰神经氨酸定量标准品 |
1 nmol |
|
CM–SRP-01 |
含 Neu5Ac、Neu5Gc 的唾液酸参比盘， |
|
|
|
Neu5,7Ac2、Neu5Gc、9Ac、Neu5,8Ac2、Neu5,9Ac2 和 |
1.25 nmol |
|
|
Neu5，x，xAc3（其中 x 是未知乙酰基位置）。 |
（总唾液酸） |
所需的其他试剂和设备
· 加热块、烘箱或类似的干式加热器，设置为 80 ℃ 用于释放唾液酸；设置为 50 ℃ 用于唾液酸标记反应
· 移液器范围 1 至 1000µL 和吸头
· 真空离心机
· 反应瓶（例如 0.5 mL 聚丙烯瓶）
· 分析级水，例如。MilliQ
· 如果需要重复，则添加唾液酸标准品 [可选]：CM-NEUAC-01；CM-NEUGC-01
· 附加唾液酸标准品 Neu5,9Ac2 [可选]： CM-NEU5,9AC-01
· 工艺阳性对照品 [建议]：Ludger 胎球蛋白糖蛋白 GCP-FET-50U
Ludger Bioquant 糖肽 BQ-GPEP-A2G2S2-10U
贴标时间线
LudgerTag™ 标记程序，包括干燥时间和从
分析样品，通常需要 7 小时加上干燥：
程序 时间
样品制备 10 min + 干燥 (1-2 h) 可在前一天进行
唾液酸的释放 3 h
DMB 标记 3.5 h
总时间： 干燥后 7 h
方法
1 样品制备
· 我们建议在整个分析过程中取三份重复等份样本。对于高唾液酸化糖蛋白，使用 50µg，对于具有低水平唾液酸化的 IgG 等样品，使用高达 200µg。
- 请注意，一些常用于蛋白质的盐/缓冲液可能干扰唾液酸分析过程。这取决于与缓冲液体积相比的取样量（因为大量缓冲液会影响酸水解过程中溶液的酸度）。在我们的 当样品浓度高于 1 mg/mL 且采集 50-200µg 样品进行分析时，经验缓冲液（如 PBS）不是问题。
· 我们建议您在整个过程中采用样品进行多项控制：阳性过程控制糖蛋白：胎球蛋白糖蛋白：GCP-FET-50U 阳性过程定量控制糖肽：BQ-GPEP-A2G2S2-10U 阴性过程控制：水
阴性过程对照：样品缓冲液
· 将样品和过程控制等分（除非已经干燥）至 0.5 mL 聚丙烯小瓶中，并在真空离心机中干燥。
2 唾液酸释放
· 将烘箱设定为 80 °C
· 向样品和过程控制小瓶中加入 25µL 2M 乙酸溶液。
不符合唾液酸标准品：Neu5Ac (CM-NEUAC-01)、Neu5Gc (CM-NEUGC-01)、唾液酸参比组 (CM-SRP-01) 小瓶；或 Neu5,9Ac2 (CM-Neu5,9,Ac-01)（如使用）。
· 涡旋溶解，然后短暂离心。
· 将样品和对照品置于设定为 80 ℃ 的烘箱中，孵育 2 小时 (±5 min)。从烘箱中取出，冷却至室温。涡旋并短暂离心。
· 从每份样品或过程对照品中取 5µL，转移至 0.5 mL 聚丙烯瓶中，准备用 DMB 标记。
如果需要，酸释放样品可在-20 ℃ 下储存至少 2 天 [Ref1]。
3 DMB 标签
· 将烘箱温度设定为 50 ℃。
· 向连二亚硫酸钠 LT-DITHIO-01 小瓶中加入 440µL 巯基乙醇溶液 LT-MERCAPTO-01，并通过移液器吹打混匀，直至固体*溶解。
· 将该溶液全部加入 DMB Dye LT-DMB-01 小瓶中，并通过移液器吹打混匀，直至染料溶解。
将标记试剂暴露于潮湿和光照条件下，并在 60 min 内使用。
· 向各样品和工艺对照品中加入 20µL 标记试剂，盖上管盖，涡旋充分混匀，然后短暂离心，确保标记溶液位于小瓶底部。
- 向各唾液酸标准品（Neu5Ac、Neu5Gc、唾液酸参比组，如需要，加 Neu5,9Ac2）中加入 20µL 标记试剂，盖上管盖，涡旋充分混匀，然后短暂离心，确保标记溶液位于小瓶底部。
将样品、对照品和标准品置于设定为 50 ℃ 的烘箱中，并在 暗处。
在孵育期间，您可以开始调节准备用于分析的 LC– 见第 4 节。
· 从烘箱中取出小瓶，向各样品和过程控制中加入 475µL 水，终止反应
向各唾液酸标准品中加入 480µL 水
4 LC 分析
稀释用于标准曲线的 Neu5Ac 和 Neu5Gc 标准品（使用表 1 作为指导，因为 Neu5Gc 的含量通常低于 Neu5Ac，Neu5Gc 曲线的范围比 Neu5Ac 低一个步骤）。混匀。
这可以在“HPLC 条件色谱柱”运行过程中完成。
|
比值 |
稀释度 因子 |
Neu5Ac 标准品 (µL) |
水 (µL) |
|
Neu5Gc 标准品 (µL) |
水 (µL) |
|
1:0 |
1 |
200 |
0 |
– |
– |
|
|
1:1 |
2 |
100 |
100 |
100 |
100 |
|
|
1:4 |
5 |
40 |
160 |
40 |
160 |
|
|
1:9 |
10 |
20 |
180 |
20 |
180 |
|
|
1:49 |
50 |
10 |
490 |
10 |
490 |
|
|
1:99 |
100 |
10 |
990 |
10 |
990 |
|
|
1:999 |
1000 |
20，从 1:99（预混） |
180 |
20 来自 1:99 （预混合） |
180 |
|
|
1:4999 |
5000 |
– |
– |
10 来自 1:49 （预混合） |
990 |
表 1. 标准品的稀释方案
· 用水（20µL 样品加 180µL 水）以 1:10（比例 1:9）稀释样品。
· 用水以 1:10（比例 1:9）稀释工艺对照品（和 Neu5,9Ac2，如使用）。
· 请勿稀释唾液酸参比组 (SRP)。
注：如果已知样品具有低水平的唾液酸化（例如 IgG）-则不得用水稀释。如果发现 LC 峰的面积不在标准曲线范围内，则制备浓度更高的样品，或延长标准曲线。
样品在自动进样器中于 10 ℃ 避光条件下可稳定储存至少 72 h [Ref2]。
· 准备 LC 系统。确保预充溶剂管路。溶剂 A = 乙腈：甲醇：水 9:7:84
溶剂 B = 乙腈
荧光：激发波长：373 nm；发射波长：448 nm 柱温 = 30 ℃；样品温度 = 10 ℃
|
时间 (min) |
流速 (mL/min) |
%A |
%B |
|
0 |
0.5 |
100 |
0 |
|
19 |
0.5 |
100 |
0 |
|
19.5 |
0.5 |
10 |
90 |
|
23.5 |
0.5 |
10 |
90 |
|
24 |
0.5 |
100 |
0 |
|
30 |
0.5 |
100 |
0 |
表 2. 采用 LudgerSep-R1 色谱柱（4.6 x 150 mm，3µm 颗粒）LS-R1-4.6 x 150 进行 HPLC 分析的 30 min 运行方法。
进样体积 = 25µL。
|
时间 (min) |
流速 (mL/min) |
%A |
%B |
|
0 |
0.25 |
100 |
0 |
|
7 |
0.25 |
100 |
0 |
|
7.5 |
0.25 |
10 |
90 |
|
8 |
0.25 |
10 |
90 |
|
8.5 |
0.25 |
100 |
0 |
|
15 |
0.25 |
100 |
0 |
表 3. 采用 LudgerSep-uR2 色谱柱 (2.1 x 100 mm，1.9) 进行 UHPLC 分析的 15 min 运行方法
µm 微粒）LS-UR2-2.1 x 100。
进样体积 = 5µL。
- 通过运行适当的方法（表 2 使用 LudgerSep-R1 色谱柱进行 HPLC 分析或表 3 使用 LudgerSep-uR2 色谱柱进行 UHPLC 分析）调节色谱柱，不进样 2/3 次。然后注入水系统空白，并检查基线是否稳定。如果不是，则保持流动注射直至基线稳定，或在再调节前，用 10%a 和 90%B 冲洗 30 min。
- 下次运行 2 次或更多次 SRP 唾液酸参比组进样，直至图谱重叠。图谱应类似于图 1 (HPLC) 或图 2 (UHPLC)。然而，保留时间的变化取决于所使用的 LC 系统。
· LC 系统现在可以运行样品组了。我们建议按照以下顺序（表 4）：
|
SRP |
|
Neu5Gc 标准曲线稀释 |
|
标准曲线的 Neu5Ac 稀释液 |
|
工艺控制（胎球蛋白、GPEP、水、缓冲液） |
|
样品 |
|
Neu5Gc 标准曲线稀释 |
|
标准曲线的 Neu5Ac 稀释液 |
|
SRP |
表 4. 进样顺序
5 验收标准
· 样本集开始和结束时 SRP 的曲线应与小漂移重叠
例如：±0.1 min。
· Neu5Gc 和 Neu5Ac 的校准曲线的 R2 值应 > 0.99。
- 根据内部 SOP 分析的胎球蛋白的 Ludger 验收范围为 252 至 377 nmol/mg 蛋白（其中，例如 34µg 胎球蛋白/50U）[Ref3]。当我们收集更多 GCP-FET-50U 的内部数据时，更新了该验收标准。在参考文献 3 中列出了历史验收范围，并进行了详细解释。
· 采用内部 SOP 分析的 GPEP-A2G2S2 的 Ludger 验收范围为 5.6-8.4 nmol。
（通过定量 NMR 测定的量±20%）
图 1：在 LudgerSep-R1 HPLC 色谱柱上运行的 DMB 标记唾液酸参比组 (CM-SRP-01) 的色谱图。
峰：1 = Neu5Gc； 2 = Neu5Ac； 3 = Neu5,7Ac2； 4 = Neu5Gc，9Ac； 5 = Neu5,8Ac2； 6 = Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中 x 是未知乙酰基位置）；* = 试剂。
注：该色谱图仅作为示例提供。峰宽、分离度和保留时间取决于您实验室的 HPLC 系统设置。
图 2：在 LudgerSep-uR2 UHPLC 色谱柱上运行 DMB 标记唾液酸参比组。
峰：1 = Neu5Gc； 2 = Neu5Ac； 3 = Neu5,7Ac2； 4 = Neu5Gc，9Ac； 5 = Neu5,8Ac2； 6 = Neu5,9Ac2；7 = Neu5,x,xAc3（其中 x 是未知乙酰基位置）；* = 试剂。
注：该色谱图仅作为示例提供。峰宽、分离度和保留时间取决于您实验室的 UHPLC 系统设置。
参考文献和相关文献
1. Ludger 文件：S-GP-0048-WG-50381-Report-v1.0. DMB 标记唾液酸冷冻影响的测定。
2. Ludger 文件：唾液酸分析用胎球蛋白质量标准-v2.0. 唾液酸分析中胎球蛋白系统适用性标准品验收标准的确定
3. Ludger 文件：DMB-kit-Validation-Report-GP-0057-v1.0. 使用 Ludger 标准品验证 DMB 试剂盒。
4. Ludger 文件：“定量唾液酸分析”的应用注释 #APN002
反应机制
标记反应为 2 步工艺。
1. 一步是将闭环（环状）唾液酸平衡至开环（无环）形式。
- 第二步遵循多步骤机制，其中 DMB 染料的伯氨基与 α-酮酸的羰基反应形成亚胺，该中间体与溶液中的还原剂反应，从而与染料的另一伯胺反应。重排得到荧光标记的唾液酸（二亚胺）。
故障排除
1. HPLC 信号较低。
- 酸水解不*：我们建议使用烘箱而不是加热块进行酸水解步骤。一些加热块导致样品瓶盖中的酸蒸发和冷凝，导致酸水解不*。我们还建议使用体积不超过 0.5 mL 的小样品瓶进行酸水解。
· 样品中的盐干扰标记：盐和缓冲液可干扰唾液酸
标记方法。如果您怀疑盐干扰您的样本，则在分析前将样本透析至无盐溶剂中。
2. 色谱图中游离染料峰的水平较高。
- 这可能是由于光暴露过多所致。确保孵育步骤在暗处进行。标记样品后，好立即在 LC 上运行，以避免降解，因为样品长时间暴露于光照和高温会导致非唾液酸特异性色谱峰增加。随着时间的推移，该问题也可能是由 LC 色谱柱污染引起的，见下文。
· 当 DMB 标记样本时，Neu5Ac 和 Neu5Gc 的量显示稳定
如果校准标准品在相同条件下储存并同时进行分析，则在 10 ℃ 下避光储存长达 72 小时 [参考文献 3]。如果不可能，则 DMB 标记的样本可以冷冻长达 2 天 [参考 1]。
3. LC 色谱峰保留时间的变化；基线不稳定。
- 错误或旧 LC 溶剂。始终以相同方式制备溶剂（使溶剂达到 例如，通过将两种溶剂混合在一起，在量筒中 1 升与单独测量两种溶剂并在瓶中混合是不相同的）。等度梯度对溶剂制备的变化特别敏感。由于蒸发，溶剂组成可能随时间变化。
· 过量游离染料/肽等污染色谱柱可导致保留时间偏移
和色谱图上的额外峰。对于唾液酸化水平较低的样品（将大量蛋白进样至色谱柱中），这可能是更多的问题。用正常运行溶剂和乙腈的 10:90 混合液以正常流速清洗色谱柱。
· (U) HPLC 系统的运行条件尚未优化。一个常见变量为
评估您是否正在使用 UHPLC，是“强/弱清洗”。这些可能对色谱产生显著影响。作为一般规则，“弱清洗”使用弱梯度条件，“强清洗”使用强梯度条件。您需要评估哪些提供了与产品指南相匹配的 SRP 跟踪。我们建议通过使用以下方法开始 LC 优化 弱洗。
4. 问题：标记液中有沉淀
- 尽管罕见，但在制备 DMB 标记溶液（连二亚硫酸钠、巯基乙醇和 DMB 染料的混合物）的过程中可能会形成轻微沉淀。我们还观察到这种情况，检测了该混合物的标记效率，并证实沉淀物不影响标记反应。
5. 唾液酸参比组 (SRP) (U) HPLC 追踪与指南中的追踪不匹配
- 确保该参比标准品未进行酸处理。酸处理后，SRP 轨迹将仅包含对应于 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的峰。
保证和责任
Ludger 保证上述产品符合随附的分析文件。如果产品因误用以外的原因失效，Ludger 将根据其选择免费更换或退还购买价格。本保证为排他性保证，Ludger 不作任何其他明示或暗示保证，包括任何暗示条件或针对任何特定目的的适销性或适用性保证。
Ludger 不对任何附带、间接或或或有损害负责。本产品仅用于体外研究。
文件修订编号
文件编号：LT-KDMB-A1-Guide-v6.3