Hifair^®III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair^®III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^®III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可合成长达19.8 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物：Random Primers N6和Oligo (dT)₁₈，用户可根据需要，选择Random Primers N6，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品信息

组分信息

*10×Hifair^® III Super Buffer 包含gDNA digester抑制剂和dNTPs。

** Hifair^® III RT Enzyme Mix 包含RNase inhibitor。

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期18个月。

使用说明

1.关于逆转录引物的选择

1）如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈ ，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。

2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3）Random Primers N6适用性较广，适用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。

2.第一链cDNA合成操作步骤

1）若实验需要去除残留基因组DNA

a.  gDNA消化

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

表1 gDNA消化体系*

*若后续实验为qPCR，Total RNA投入量为10 pg -1 μg；mRNA的投入量为10 pg-100 ng。若基因的表达丰度很低，最多可投入5 ug Total RNA或500 ng mRNA。

b. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

表2逆转录体系(以20 μL为例)*

*使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

1）逆转录引物：后续进行qPCR时，推荐Random Primers N6与Oligo (dT)₁₈ 1:1混合使用。

2）建议先加入10×Hifair^® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c. 逆转录标准程序设置

表3逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

表4逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

2）若实验无需去除残留基因组DNA

a. RNA模板变性

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5 min，迅速置于冰上，并静置3 min。

表5 RNA模板变性体系

b. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

表6逆转录体系(以20 μL为例)*

c. 逆转录标准程序设置

表7逆转录标准程序*

*标准程序设置建议。

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

d. 逆转录快速程序设置

表8逆转录快速程序*

*逆转录快速程序适用于中低GC含量（≤55%）或者常规模板后续的荧光定量实验。

e. 产物保存

逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

3）miRNA第一链cDNA茎环法合成操作步骤

a.  gDNA消化

在RNase-free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

表9 gDNA消化体系

b.  miRNA逆转录反应体系配制（20 μL体系）

表10 miRNA逆转录体系(以20 μL为例)*

*1）建议先加入10×Hifair^® III Super Buffer混匀后再添加逆转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

*2）体系配制完成后，请用移液器轻轻吹打混匀。

c.  miRNA逆转录标准程序设置

表11 miRNA标准扩增程序*

*a. 逆转录时间：后续进行qPCR时，推荐15 min；若后续用于PCR时，推荐30 min-60 min。

注意事项

1. 反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。
2. 建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。
3. 5×gDNA digester Mix、10×Hifair^® III Super Buffer、Hifair^® III RT Enzyme Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀，并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器，枪头不要插入液面下过深。
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
5. qPCR实验推荐基因组去除步骤，保证结果更加真实可靠。
6. 本产品仅作科研用途！

Ver.CN20230407

Q：逆转录试剂盒可以逆转真菌（或其他物种）RNA 吗？有没有专门针对真菌（或其他物种）的RNA 逆转录的试剂盒呢？

A：RNA 的物种与逆转录没有很大关系，RNA 质量与逆转录有关。所以，得到 RNA 后， 逆转录试剂盒都可以用，没有特别针对的。

Q：RNase 残留降解RNA？

A：原因：若去除试剂中残留 RNase，会使 RNA 发生降解，减少了 RNA 模板量，导致效果差。

检测方法：RNA 去除试剂前后分别进行电泳检测，检测RNA 完整性。优化方法：选用无RNase 级别的 gDNA 去除试剂。

Q: miRNA茎环法逆转录可以用这款产品吗？

A: 可以的，设计特异性引物替代试剂盒中的引物加入到程序中。参考程序如下：

茎环引物（10uM) :1ul

上一步的反应液：15ul

10×super buffer：2ul

RT enzyme mix: 1ul

ddH2O:  1ul

[1] Ba F, Liu Y, Liu WQ, Tian X, Li J. SYMBIOSIS: synthetic manipulable biobricks via orthogonal serine integrase systems. Nucleic Acids Res. 2022;50(5):2973-2985. doi:10.1093/nar/gkac124(IF:16.971)
[2] Zhang Y, Ding H, Wang X, et al. MK2 promotes Tfcp2l1 degradation via β-TrCP ubiquitin ligase to regulate mouse embryonic stem cell self-renewal. Cell Rep. 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949(IF:9.423)
[3] Liu X, Zhan T, Gao Y, et al. Benzophenone-1 induced aberrant proliferation and metastasis of ovarian cancer cells via activated ERα and Wnt/β-catenin signaling pathways. Environ Pollut. 2022;292(Pt B):118370. doi:10.1016/j.envpol.2021.118370(IF:8.071)
[4] Li C, Song J, Guo Z, et al. EZH2 Inhibitors Suppress Colorectal Cancer by Regulating Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Front Immunol. 2022;13:857808. Published 2022 Apr 1. doi:10.3389/fimmu.2022.857808(IF:7.561)
[5] Wu Z, Lu Z, Li L, et al. Identification and Validation of Ferroptosis-Related LncRNA Signatures as a Novel Prognostic Model for Colon Cancer. Front Immunol. 2022;12:783362. Published 2022 Jan 26. doi:10.3389/fimmu.2021.783362(IF:7.561)
[6] Zhang Y, Hu R, Xi B, Nie D, Xu H, Liu A. Mechanisms of Senescence-Related NKG2D Ligands Release and Immune Escape Induced by Chemotherapy in Neuroblastoma Cells. Front Cell Dev Biol. 2022;10:829404. Published 2022 Mar 2. doi:10.3389/fcell.2022.829404(IF:6.684)
[7] Zheng XR, Zhang MJ, Qiao YH, et al. Cyclocarya paliurus Reprograms the Flavonoid Biosynthesis Pathway Against Colletotrichum fructicola. Front Plant Sci. 2022;13:933484. Published 2022 Jun 30. doi:10.3389/fpls.2022.933484(IF:6.627)
[8] Tian Q, Zhou LQ. Lactate Activates Germline and Cleavage Embryo Genes in Mouse Embryonic Stem Cells. Cells. 2022;11(3):548. Published 2022 Feb 4. doi:10.3390/cells11030548(IF:6.600)
[9] Zhang W, Lin J, Li J, et al. Rambutan genome revealed gene networks for spine formation and aril development. Plant J. 2021;108(4):1037-1052. doi:10.1111/tpj.15491(IF:6.486)
[10] Fu S, Tan R, Feng Y, et al. N-methyl-N-nitrosourea induces zebrafish anomalous angiogenesis through Wnt/β-catenin pathway [published online ahead of print, 2022 May 25]. Ecotoxicol Environ Saf. 2022;239:113674. doi:10.1016/j.ecoenv.2022.113674(IF:6.291)
[11] Wang G, Wang X, Ma H, et al. PcWRKY11, an II-d WRKY Transcription Factor from Polygonum cuspidatum, Enhances Salt Tolerance in Transgenic Arabidopsis thaliana. Int J Mol Sci. 2022;23(8):4357. Published 2022 Apr 14. doi:10.3390/ijms23084357(IF:5.924)
[12] Xing YJ, Liu BH, Wan SJ, et al. A SGLT2 Inhibitor Dapagliflozin Alleviates Diabetic Cardiomyopathy by Suppressing High Glucose-Induced Oxidative Stress in vivo and in vitro. Front Pharmacol. 2021;12:708177. Published 2021 Jul 12. doi:10.3389/fphar.2021.708177(IF:5.811)
[13] Wei MP, Yu H, Guo YH, Cheng YL, Xie YF, Yao WR. Synergistic antibacterial combination of Sapindoside A and B changes the fatty acid compositions and membrane properties of Cutibacterium acnes [published online ahead of print, 2021 Nov 19]. Microbiol Res. 2021;255:126924. doi:10.1016/j.micres.2021.126924(IF:5.415)
[14] Li N, Chen J, Geng C, et al. Myoglobin promotes macrophage polarization to M1 type and pyroptosis via the RIG-I/Caspase1/GSDMD signaling pathway in CS-AKI. Cell Death Discov. 2022;8(1):90. Published 2022 Feb 28. doi:10.1038/s41420-022-00894-w(IF:5.241)
[15] Zhang Q, Yang R, Tian Y, et al. Ribavirin inhibits cell proliferation and metastasis and prolongs survival in soft tissue sarcomas by downregulating both protein arginine methyltransferases 1 and 5. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2022;131(1):18-33. doi:10.1111/bcpt.13736(IF:4.084)
[16] Wang PT, Li N, Wang XY, et al. RIG-I, a novel DAMPs sensor for myoglobin activates NF-κB/caspase-3 signaling in CS-AKI model. Mil Med Res. 2021;8(1):37. Published 2021 Jun 21. doi:10.1186/s40779-021-00333-4(IF:3.329)
[17] Peng G, Zhu C, Sun Q, et al. Testicular miRNAs and tsRNAs provide insight into gene regulation during overwintering and reproduction of Onychostoma macrolepis. Fish Physiol Biochem. 2022;48(3):481-499. doi:10.1007/s10695-022-01078-0(IF:2.794)
[18] Ye Z, Xu YJ, Liu Y. Influence of different dietary oil consumption on nutrient malabsorption: An animal trial using Sprague Dawley rats. J Food Biochem. 2021;45(4):e13695. doi:10.1111/jfbc.13695(IF:2.720)
[19] Li Y, Qin G, Du J, Yue P, Zhang Y, Hou N. circRNA LDLRAD3 Enhances the Malignant Behaviors of NSCLC Cells via the miR-20a-5p-SLC7A5 Axis Activating the mTORC1 Signaling Pathway. J Healthc Eng. 2022;2022:2373580. Published 2022 Jan 6. doi:10.1155/2022/2373580(IF:2.682)
[20] Peng G, Sun Q, Chen Y, et al. A comprehensive overview of ovarian small non-coding RNAs in the late overwintering and breeding periods of Onychostoma macrolepis. Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics. 2022;42:100967. doi:10.1016/j.cbd.2022.100967(IF:2.674)
[21] Xu Y, Peng W, Han D, et al. Maiwei Yangfei decoction prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. Exp Ther Med. 2021;22(5):1306. doi:10.3892/etm.2021.10741(IF:2.447)