产品描述

IHC Kit for Rabbit Primary Antibody可用于检测以兔单克隆或多克隆抗体为一抗的免疫组化实验，检测原理基于高特异性高亲和力的链霉亲和素–生物素结合：已固定或培养细胞的抗原与一抗形成抗原抗体复合物，生物素化二抗特异性结合上述复合物，经辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素特异性识别生物素（即抗原所在位置），最后经辣根过氧化物酶底物显色即可检测相应抗原。

本品可适用于多种类型样本，如石蜡包埋切片、冰冻切片、培养细胞涂片及血液标本等。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输。Part Ⅱ，H,I组分-20℃保存，其他组分4℃保存，有效期1年。勿冰冻！

注意事项

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.DAB是一潜在致癌物，使用时请注意自我防护。

3.检测样本时需同时做阴性对照和阳性对照。

4.本产品仅作科研用途！

准备试剂

二甲苯、乙醇、甲醇、去离子水、封片剂（Cat#36313）

使用方法

1.脱蜡水化:将石蜡切片置于新鲜二甲苯中浸泡15 min，重复三次。去除多余的液体后，依次置于无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，各浸泡5 min，蒸馏水（或自来水）冲洗5 min。用PBS缓冲液（试剂A，将干粉溶解于2 L去离子水中）冲洗切片5 min，重复三次。

2.抗原修复:将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的耐高温塑料切片架上，加适量修复液1×柠檬酸钠抗原修复液（试剂B，将100×柠檬酸钠抗原修复液加去离子水稀释成1×柠檬酸钠抗原修复液），液面要浸过切片组织一定高度，将修复盒置于沸水中煮沸修复15 min后取出玻片，自然凉至室温。用PBS缓冲液冲洗切片5 min，重复三次。注意：抗原修复时，修复液务必保证切片始终浸泡在液体内，一般情况：修复液的量约为800 mL/1架。

3.阻断内源性过氧化物酶:用吸水纸擦干玻片，免疫组化笔在组织周围画圈，滴加50 μL内源性过氧化物酶阻断剂（试剂C）到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育30 min，用PBS缓冲液冲洗切片5 min，重复三次。

4.血清封闭:用吸水纸擦干玻片，滴加50 μL正常山羊血清工作液（试剂E），37℃封闭20 min，以减少非特异性染色。

5.一抗孵育:用抗体稀释液（试剂 D）将一抗原液稀释成工作液，用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，滴加适量抗体工作液，置于孵育盒4℃孵育过夜或37℃孵育1h–2h。

6.复温:4℃过夜后从冰箱拿出样本，在室温下孵育15 min复温（抗体孵育为4℃过夜选用此步骤，如室温孵育直接进入下一步清洗）。用PBS缓冲液冲洗切片5 min，重复三次。

7.二抗孵育:吸水纸擦干切片后滴加50 μL生物素标记的羊抗兔IgG（试剂F），37℃孵育20 min，用PBS缓冲液冲洗切片5 min，重复三次。

8.三抗孵育:吸水纸擦干切片后滴加50 μL 辣根酶标记的链酶卵白素孵育（试剂G），37℃孵育20 min，用PBS缓冲液冲洗切片5 min，重复三次。

9.显色:甩去 PBS 缓冲液，吸水纸擦干切片；每张切片滴加新鲜配制的DAB工作液50 μL（试剂H：试剂I：试剂A=1:1:18比例配置），孵育3-5 min，光学显微镜下观察染色结果，切勿显色过深；显色后用自来水冲洗切片终止显色。

【注】:1. DAB显色液需现配现用，避光放置，且在30 min内使用。

2.可根据需要一次染多张切片，各种试剂量按照上述比例放大即可。

10.复染:滴加适量苏木素染液（试剂J）复染，孵育1-5 min，自来水冲洗5 min，滴加盐酸酒精分化液分化30 sec，自来水冲洗。

11.脱水封片:将玻片依次置于70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇，各浸泡 5 min，再将玻片放入二甲苯

中浸泡15 min，重复三次。玻片取出来稍晾干，用中性树胶封片。

12.结果判定:

在光学显微镜下对染色的切片观察并判断。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显色的阳性表达为棕黄色。

HB221025

Q：该产品适用于石蜡包埋切片、冰冻切片、培养细胞涂片及血液标本吗？

A：适用。

Q：该产品需在 4℃下储存吗？

A：部分Ⅱ，H，I 组分-20℃保存，其他组分 4℃保存，勿冰冻。

Q：配置好的 DAB 显色液可以保存多久？

A：DAB 显色液需现配现用，避光放置，且在 30 min 内使用。

Q：该产品可一次染多张切片吗？

A：可根据需要一次染多张切片，各种试剂量按照说明书比例放大即可。

[1] Li M, Li SC, Dou BK, et al. Cycloastragenol upregulates SIRT1 expression, attenuates apoptosis and suppresses neuroinflammation after brain ischemia. Acta Pharmacol Sin. 2020;41(8):1025-1032. doi:10.1038/s41401-020-0386-6(IF:5.064)