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Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set1|Hieff NGS®Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 1

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Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set1|Hieff NGS®Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 1

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量文库构建专用配套试剂盒，共分为4个Set，每个Set中包含12种不同的Barcode接头，适用于Illumina®高通量测序平台多样品DNA文库构建。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度保证了文库构建的稳定性和可重复性。

 

产品组分

编号

组分

产品规格

12×4 T

12×16 T

12615

DNA Adapter 1-12

14 μL each

56 μL each

12616

DNA Adapter 13-24

14 μL each

56 μL each

12617

DNA Adapter 25-36

14 μL each

56 μL each

12618

DNA Adapter 37-48

14 μL each

56 μL each

 

运输和保存方法

冰袋运输，-20℃保存，有效期18个月。

 

注意事项

1）本试剂盒中DNA Adapter的浓度统一为15 μM，单个文库构建的接头使用量根据所用试剂盒进行调整。

2）切勿加热接头，应在室温让其缓慢溶解，实验室温度最好设置为20-25℃。接头避免反复冻融，可短暂存放于4℃。

3）小规格试剂盒（12×4 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行4个DNA文库构建，共计足够进行48个DNA文库构建，大规格试剂盒（12×16 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行16个DNA文库构建，共计足够进行192个DNA文库构建。

4）使用Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®试剂盒构建的DNA文库结构如下：

5’ – Universal Adapter – Insert DNA Sequence – DNA Barcode Adapter- 3’

5）试剂盒中提供的每种DNA Adapter中都包含Universal Adapter，且提供一种Barcode序列标签，用于高通量测序时区分样品。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7）本产品仅用作科研用途！

 

使用方法

DNA Adapter的序列如下：

Universal Adapter：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

Barcode Adapter：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXX1ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

1XXXXXX表示接头的Barcode区域，其在每个接头中的序列见下表。测序前在Sample Sheet中只需输入这个Barcode序列（6 bp）即可。

名称

序列

 

名称

序列

DNA Adapter 1

CGATGT

 

DNA Adapter 25

ACTGAT

DNA Adapter 2

TGACCA

 

DNA Adapter 26

ATGAGC

DNA Adapter 3

ACAGTG

 

DNA Adapter 27

ATTCCT

DNA Adapter 4

GCCAAT

 

DNA Adapter 28

CAAAAG

DNA Adapter 5

CAGATC

 

DNA Adapter 29

CAACTA

DNA Adapter 6

CTTGTA

 

DNA Adapter 30

CACCGG

DNA Adapter 7

ATCACG

 

DNA Adapter 31

CACGAT

DNA Adapter 8

TTAGGC

 

DNA Adapter 32

CACTCA

DNA Adapter 9

ACTTGA

 

DNA Adapter 33

CAGGCG

DNA Adapter 10

GATCAG

 

DNA Adapter 34

CATGGC

DNA Adapter 11

TAGCTT

 

DNA Adapter 35

CATTTT

DNA Adapter 12

GGCTAC

 

DNA Adapter 36

CCAACA

DNA Adapter 13

AGTCAA

 

DNA Adapter 37

CGGAAT

DNA Adapter 14

AGTTCC

 

DNA Adapter 38

CTAGCT

DNA Adapter 15

ATGTCA

 

DNA Adapter 39

CTATAC

DNA Adapter 16

CCGTCC

 

DNA Adapter 40

CTCAGA

DNA Adapter 17

GTAGAG

 

DNA Adapter 41

GCGCTA

DNA Adapter 18

GTCCGC

 

DNA Adapter 42

TAATCG

DNA Adapter 19

GTGAAA

 

DNA Adapter 43

TACAGC

DNA Adapter 20

GTGGCC

 

DNA Adapter 44

TATAAT

DNA Adapter 21

GTTTCG

 

DNA Adapter 45

TCATTC

DNA Adapter 22

CGTACG

 

DNA Adapter 46

TCCCGA

DNA Adapter 23

GAGTGG

 

DNA Adapter 47

TCGAAG

DNA Adapter 24

GGTAGC

 

DNA Adapter 48

TCGGCA

推荐Barcode组合：

2个样本：可使用（4, 6）、或（3, 19）。

3个样本：可使用（4, 6, 其他任意1个barcode）、或（3, 19, 其他任意1个barcode）、或（1, 5, 19）、或（3, 12, 15）等。

4个样本：可使用（4, 6, 其他任意2个barcode）、或（3, 19, 其他任意2个barcode）、或（3, 4, 6, 19）、或（1, 2, 5, 16）等。

 

HB221128

Q：构建得到的文库产量低的原因？

A：1、DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等）

Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在 TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。

2、RNA 污染

样本中存在 RNA 污染会导致 DNA 定量不准确，使文库构建时 DNA 上样量不足。

3、PCR free 的时候上样量不足

当使用完整接头且 Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直接测序，可在接头连接完成后对 DNA 文库进行 PCR 扩增。

4、接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。判断接头是否降解的方法：

a.用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。

b.用 Qubit、酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。

检测方法：取 1uL，15uM 的 complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。

Q：最后一步扩增，短接头中 Primer 和长接头的 Primer 是否一致？

A：不一致。短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的 DNA 文库。长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同 Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物 Primer Mix 扩增完整的文库，使用长接头时，若在 PCR 扩增之前文库浓度就达到上机要求，则无需进行 PCR 文库扩增。

Q：接头中 index/Barcode 组合原则是什么？

A：碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文“一文全面解析 NGS 接头的奥秘”）

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set1|Hieff NGS®Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 1

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产品描述

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量文库构建专用配套试剂盒，共分为4个Set，每个Set中包含12种不同的Barcode接头，适用于Illumina®高通量测序平台多样品DNA文库构建。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度保证了文库构建的稳定性和可重复性。

 

产品组分

编号

组分

产品规格

12×4 T

12×16 T

12615

DNA Adapter 1-12

14 μL each

56 μL each

12616

DNA Adapter 13-24

14 μL each

56 μL each

12617

DNA Adapter 25-36

14 μL each

56 μL each

12618

DNA Adapter 37-48

14 μL each

56 μL each

 

运输和保存方法

冰袋运输，-20℃保存，有效期18个月。

 

注意事项

1）本试剂盒中DNA Adapter的浓度统一为15 μM，单个文库构建的接头使用量根据所用试剂盒进行调整。

2）切勿加热接头，应在室温让其缓慢溶解，实验室温度最好设置为20-25℃。接头避免反复冻融，可短暂存放于4℃。

3）小规格试剂盒（12×4 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行4个DNA文库构建，共计足够进行48个DNA文库构建，大规格试剂盒（12×16 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行16个DNA文库构建，共计足够进行192个DNA文库构建。

4）使用Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®试剂盒构建的DNA文库结构如下：

5’ – Universal Adapter – Insert DNA Sequence – DNA Barcode Adapter- 3’

5）试剂盒中提供的每种DNA Adapter中都包含Universal Adapter，且提供一种Barcode序列标签，用于高通量测序时区分样品。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7）本产品仅用作科研用途！

 

使用方法

DNA Adapter的序列如下：

Universal Adapter：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

Barcode Adapter：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXX1ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

1XXXXXX表示接头的Barcode区域，其在每个接头中的序列见下表。测序前在Sample Sheet中只需输入这个Barcode序列（6 bp）即可。

名称

序列

 

名称

序列

DNA Adapter 1

CGATGT

 

DNA Adapter 25

ACTGAT

DNA Adapter 2

TGACCA

 

DNA Adapter 26

ATGAGC

DNA Adapter 3

ACAGTG

 

DNA Adapter 27

ATTCCT

DNA Adapter 4

GCCAAT

 

DNA Adapter 28

CAAAAG

DNA Adapter 5

CAGATC

 

DNA Adapter 29

CAACTA

DNA Adapter 6

CTTGTA

 

DNA Adapter 30

CACCGG

DNA Adapter 7

ATCACG

 

DNA Adapter 31

CACGAT

DNA Adapter 8

TTAGGC

 

DNA Adapter 32

CACTCA

DNA Adapter 9

ACTTGA

 

DNA Adapter 33

CAGGCG

DNA Adapter 10

GATCAG

 

DNA Adapter 34

CATGGC

DNA Adapter 11

TAGCTT

 

DNA Adapter 35

CATTTT

DNA Adapter 12

GGCTAC

 

DNA Adapter 36

CCAACA

DNA Adapter 13

AGTCAA

 

DNA Adapter 37

CGGAAT

DNA Adapter 14

AGTTCC

 

DNA Adapter 38

CTAGCT

DNA Adapter 15

ATGTCA

 

DNA Adapter 39

CTATAC

DNA Adapter 16

CCGTCC

 

DNA Adapter 40

CTCAGA

DNA Adapter 17

GTAGAG

 

DNA Adapter 41

GCGCTA

DNA Adapter 18

GTCCGC

 

DNA Adapter 42

TAATCG

DNA Adapter 19

GTGAAA

 

DNA Adapter 43

TACAGC

DNA Adapter 20

GTGGCC

 

DNA Adapter 44

TATAAT

DNA Adapter 21

GTTTCG

 

DNA Adapter 45

TCATTC

DNA Adapter 22

CGTACG

 

DNA Adapter 46

TCCCGA

DNA Adapter 23

GAGTGG

 

DNA Adapter 47

TCGAAG

DNA Adapter 24

GGTAGC

 

DNA Adapter 48

TCGGCA

推荐Barcode组合：

2个样本：可使用（4, 6）、或（3, 19）。

3个样本：可使用（4, 6, 其他任意1个barcode）、或（3, 19, 其他任意1个barcode）、或（1, 5, 19）、或（3, 12, 15）等。

4个样本：可使用（4, 6, 其他任意2个barcode）、或（3, 19, 其他任意2个barcode）、或（3, 4, 6, 19）、或（1, 2, 5, 16）等。

 

HB221128

Q：构建得到的文库产量低的原因？

A：1、DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等）

Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在 TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。

2、RNA 污染

样本中存在 RNA 污染会导致 DNA 定量不准确，使文库构建时 DNA 上样量不足。

3、PCR free 的时候上样量不足

当使用完整接头且 Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直接测序，可在接头连接完成后对 DNA 文库进行 PCR 扩增。

4、接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。判断接头是否降解的方法：

a.用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。

b.用 Qubit、酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。

检测方法：取 1uL，15uM 的 complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。

Q：最后一步扩增，短接头中 Primer 和长接头的 Primer 是否一致？

A：不一致。短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的 DNA 文库。长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同 Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物 Primer Mix 扩增完整的文库，使用长接头时，若在 PCR 扩增之前文库浓度就达到上机要求，则无需进行 PCR 文库扩增。

Q：接头中 index/Barcode 组合原则是什么？

A：碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文“一文全面解析 NGS 接头的奥秘”）

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set1|Hieff NGS®Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 1

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Hieff Unicon®2×实时多重荧光定量 PCR|TaqMan multiplex qPCR master mix

发表于由

Hieff Unicon®2×实时多重荧光定量 PCR|TaqMan multiplex qPCR master mix

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述

本产品是2×Mix预混合试剂，能够实现在单个反应孔中进行多重荧光定量PCR。本产品含有基因改造的热启动Taq酶，极大地提高了扩增灵敏度和特异性，本产品对多重反应缓冲体系进行了深度优化，能够提高反应的扩增效率，促进低浓度模板的有效扩增。本产品可用于基因分型和基因多重定量分析。

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

11208ES03

(1 mL)

11208ES06

(5 × 1mL)

11208ES08

(5 mL)

11208ES60

(20×5 mL)

11208-A

2×Hieff Unicon® TaqMan Multiplex qPCR Master Mix

1 mL

5 × 1 mL

5 mL

20 × 5 mL

11208-B

50×Low Rox 

40 μL

200 μL

200 μL

20 × 200 μL

11208-C

50×High Rox 

40 μL

200 μL

200 μL

20 × 200 μL

 

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C储存，有效期18个月。

 

反应体系

组分

体积（μL）

终浓度

Hieff Unicon® TaqMan Multiplex qPCR Master Mix

10

1×

Primer mix

x

0.1-1 μM

TaqMan Probe mix

y

50–300 nM

50×Low or High Rox

0.4

1×

模板DNA/cDNA

1-100 ng

–

ddH2O

up to 20

–

【注】

a. 上表中模板量和引物浓度以及探针浓度均为推荐量，可根据具体实验情况进行调整，选择最适投入量和浓度

b. 一般情况下，每条引物浓度为 0.2 μM 即可得到较好的扩增效果，引物浓度可在 0.1-1 μM 的范围内进行调节；

c. 反应体系可根据实验需求进行等比例调节，模板体积不超过总体积的 1/10。

 

适用机型

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

参考扩增程序

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95°C

5 min

1

变性

95°C

5 sec

40

退火/延伸

60°C

30 sec

【注】

a. 某些情况下，可通过调节退火延伸时间提高多重 qPCR 反应的性能； 

b. 反应结束后可通过琼脂糖凝胶电泳确认产物的特异性；

 

注意事项

1. 请于使用前确保产品完全解冻并彻底混匀，短暂离心收集至管底后置于冰上备用。

2. 为避免样品间交叉污染和气溶胶污染，推荐在超净台中进行反应体系的配制。

3. 使用过程中避免产品的反复冻融。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

HB220808

Q：11208 跟 11205 有什么区别？

A：酶不一样，11208 是可以做多重PCR，11205 只能做单重PCR，做qPCR 是没有问题的。

Q：11208 的qPCR 反应体系可以用 5 μL/10 μL 吗？

A：可以，但一般推荐 20ul。大体系减少误差。5μl 体系太小，加样误差会很大，不推荐。

Q：11208 可扩增多长的产物啊？

A：建议在 300bp 以下，过长的产物会导致酶效降低。若一定要用，建议用三步法。

[1] Han S, Cao D, Sha J, Zhu X, Chen D. LncRNA ZFPM2-AS1 promotes lung adenocarcinoma progression by interacting with UPF1 to destabilize ZFPM2. Mol Oncol. 2020;14(5):1074-1088. doi:10.1002/1878-0261.12631(IF:6.574)
[2] Zhang Y, Fang Z, Guo X, et al. lncRNA B4GALT1-AS1 promotes colon cancer cell stemness and migration by recruiting YAP to the nucleus and enhancing YAP transcriptional activity. J Cell Physiol. 2019;234(10):18524-18534. doi:10.1002/jcp.28489(IF:4.522)
[3] Li H, Liu F, Qin W. Circ_0072083 interference enhances growth-inhibiting effects of cisplatin in non-small-cell lung cancer cells via miR-545-3p/CBLL1 axis. Cancer Cell Int. 2020;20:78. Published 2020 Mar 12. doi:10.1186/s12935-020-1162-x(IF:4.175)
[4] Zhao W, Wu M, Cui L, Du W. Limonin attenuates the stemness of cervical carcinoma cells by promoting YAP nuclear-cytoplasmic translocation. Food Chem Toxicol. 2019;125:621-628. doi:10.1016/j.fct.2019.02.011(IF:3.775)
[5] Cao X, Zhang C, Zhang X, Chen Y, Zhang H. MiR-145 negatively regulates TGFBR2 signaling responsible for sepsis-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 2019;111:852-858. doi:10.1016/j.biopha.2018.12.138(IF:3.743)
[6] Su Z, Wang C, Chang D, Zhu X, Sai C, Pei J. Limonin attenuates the stemness of breast cancer cells via suppressing MIR216A methylation. Biomed Pharmacother. 2019;112:108699. doi:10.1016/j.biopha.2019.108699(IF:3.743)
[7] Zhang C, Li J, Qiu X, Chen Y, Zhang X. SUMO protease SENP1 acts as a ceRNA for TGFBR2 and thus activates TGFBR2/Smad signaling responsible for LPS-induced sepsis. Biomed Pharmacother. 2019;112:108620. doi:10.1016/j.biopha.2019.108620(IF:3.743)
[8] Ma F, Li Z, Cao J, Kong X, Gong G. A TGFBR2/SMAD2/DNMT1/miR-145 negative regulatory loop is responsible for LPS-induced sepsis. Biomed Pharmacother. 2019;112:108626. doi:10.1016/j.biopha.2019.108626(IF:3.743)
[9] Guo J, Zhang L, Lian L, Hao M, Chen S, Hong Y. CircATP2B4 promotes hypoxia-induced proliferation and migration of pulmonary arterial smooth muscle cells via the miR-223/ATR axis. Life Sci. 2020;262:118420. doi:10.1016/j.lfs.2020.118420(IF:3.647)
[10] Song H, Xu Y, Shi L, et al. LncRNA THOR increases the stemness of gastric cancer cells via enhancing SOX9 mRNA stability. Biomed Pharmacother. 2018;108:338-346. doi:10.1016/j.biopha.2018.09.057(IF:3.457)
[11] Lou W, Yan J, Wang W. Downregulation of miR-497-5p Improves Sepsis-Induced Acute Lung Injury by Targeting IL2RB. Biomed Res Int. 2021;2021:6624702. Published 2021 Apr 12. doi:10.1155/2021/6624702(IF:3.411)
[12] Song H, Shi L, Xu Y, et al. BRD4 promotes the stemness of gastric cancer cells via attenuating miR-216a-3p-mediated inhibition of Wnt/β-catenin signaling. Eur J Pharmacol. 2019;852:189-197. doi:10.1016/j.ejphar.2019.03.018(IF:3.170)

产品描述

本产品是2×Mix预混合试剂，能够实现在单个反应孔中进行多重荧光定量PCR。本产品含有基因改造的热启动Taq酶，极大地提高了扩增灵敏度和特异性，本产品对多重反应缓冲体系进行了深度优化，能够提高反应的扩增效率，促进低浓度模板的有效扩增。本产品可用于基因分型和基因多重定量分析。

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

11208ES03

(1 mL)

11208ES06

(5 × 1mL)

11208ES08

(5 mL)

11208ES60

(20×5 mL)

11208-A

2×Hieff Unicon® TaqMan Multiplex qPCR Master Mix

1 mL

5 × 1 mL

5 mL

20 × 5 mL

11208-B

50×Low Rox 

40 μL

200 μL

200 μL

20 × 200 μL

11208-C

50×High Rox 

40 μL

200 μL

200 μL

20 × 200 μL

 

运输和保存方法

冰袋运输。-20°C储存，有效期18个月。

 

反应体系

组分

体积（μL）

终浓度

Hieff Unicon® TaqMan Multiplex qPCR Master Mix

10

1×

Primer mix

x

0.1-1 μM

TaqMan Probe mix

y

50–300 nM

50×Low or High Rox

0.4

1×

模板DNA/cDNA

1-100 ng

–

ddH2O

up to 20

–

【注】

a. 上表中模板量和引物浓度以及探针浓度均为推荐量，可根据具体实验情况进行调整，选择最适投入量和浓度

b. 一般情况下，每条引物浓度为 0.2 μM 即可得到较好的扩增效果，引物浓度可在 0.1-1 μM 的范围内进行调节；

c. 反应体系可根据实验需求进行等比例调节，模板体积不超过总体积的 1/10。

 

适用机型

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.

参考扩增程序

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95°C

5 min

1

变性

95°C

5 sec

40

退火/延伸

60°C

30 sec

【注】

a. 某些情况下，可通过调节退火延伸时间提高多重 qPCR 反应的性能； 

b. 反应结束后可通过琼脂糖凝胶电泳确认产物的特异性；

 

注意事项

1. 请于使用前确保产品完全解冻并彻底混匀，短暂离心收集至管底后置于冰上备用。

2. 为避免样品间交叉污染和气溶胶污染，推荐在超净台中进行反应体系的配制。

3. 使用过程中避免产品的反复冻融。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

HB220808

Q：11208 跟 11205 有什么区别？

A：酶不一样，11208 是可以做多重PCR，11205 只能做单重PCR，做qPCR 是没有问题的。

Q：11208 的qPCR 反应体系可以用 5 μL/10 μL 吗？

A：可以，但一般推荐 20ul。大体系减少误差。5μl 体系太小，加样误差会很大，不推荐。

Q：11208 可扩增多长的产物啊？

A：建议在 300bp 以下，过长的产物会导致酶效降低。若一定要用，建议用三步法。

[1] Han S, Cao D, Sha J, Zhu X, Chen D. LncRNA ZFPM2-AS1 promotes lung adenocarcinoma progression by interacting with UPF1 to destabilize ZFPM2. Mol Oncol. 2020;14(5):1074-1088. doi:10.1002/1878-0261.12631(IF:6.574)
[2] Zhang Y, Fang Z, Guo X, et al. lncRNA B4GALT1-AS1 promotes colon cancer cell stemness and migration by recruiting YAP to the nucleus and enhancing YAP transcriptional activity. J Cell Physiol. 2019;234(10):18524-18534. doi:10.1002/jcp.28489(IF:4.522)
[3] Li H, Liu F, Qin W. Circ_0072083 interference enhances growth-inhibiting effects of cisplatin in non-small-cell lung cancer cells via miR-545-3p/CBLL1 axis. Cancer Cell Int. 2020;20:78. Published 2020 Mar 12. doi:10.1186/s12935-020-1162-x(IF:4.175)
[4] Zhao W, Wu M, Cui L, Du W. Limonin attenuates the stemness of cervical carcinoma cells by promoting YAP nuclear-cytoplasmic translocation. Food Chem Toxicol. 2019;125:621-628. doi:10.1016/j.fct.2019.02.011(IF:3.775)
[5] Cao X, Zhang C, Zhang X, Chen Y, Zhang H. MiR-145 negatively regulates TGFBR2 signaling responsible for sepsis-induced acute lung injury. Biomed Pharmacother. 2019;111:852-858. doi:10.1016/j.biopha.2018.12.138(IF:3.743)
[6] Su Z, Wang C, Chang D, Zhu X, Sai C, Pei J. Limonin attenuates the stemness of breast cancer cells via suppressing MIR216A methylation. Biomed Pharmacother. 2019;112:108699. doi:10.1016/j.biopha.2019.108699(IF:3.743)
[7] Zhang C, Li J, Qiu X, Chen Y, Zhang X. SUMO protease SENP1 acts as a ceRNA for TGFBR2 and thus activates TGFBR2/Smad signaling responsible for LPS-induced sepsis. Biomed Pharmacother. 2019;112:108620. doi:10.1016/j.biopha.2019.108620(IF:3.743)
[8] Ma F, Li Z, Cao J, Kong X, Gong G. A TGFBR2/SMAD2/DNMT1/miR-145 negative regulatory loop is responsible for LPS-induced sepsis. Biomed Pharmacother. 2019;112:108626. doi:10.1016/j.biopha.2019.108626(IF:3.743)
[9] Guo J, Zhang L, Lian L, Hao M, Chen S, Hong Y. CircATP2B4 promotes hypoxia-induced proliferation and migration of pulmonary arterial smooth muscle cells via the miR-223/ATR axis. Life Sci. 2020;262:118420. doi:10.1016/j.lfs.2020.118420(IF:3.647)
[10] Song H, Xu Y, Shi L, et al. LncRNA THOR increases the stemness of gastric cancer cells via enhancing SOX9 mRNA stability. Biomed Pharmacother. 2018;108:338-346. doi:10.1016/j.biopha.2018.09.057(IF:3.457)
[11] Lou W, Yan J, Wang W. Downregulation of miR-497-5p Improves Sepsis-Induced Acute Lung Injury by Targeting IL2RB. Biomed Res Int. 2021;2021:6624702. Published 2021 Apr 12. doi:10.1155/2021/6624702(IF:3.411)
[12] Song H, Shi L, Xu Y, et al. BRD4 promotes the stemness of gastric cancer cells via attenuating miR-216a-3p-mediated inhibition of Wnt/β-catenin signaling. Eur J Pharmacol. 2019;852:189-197. doi:10.1016/j.ejphar.2019.03.018(IF:3.170)

Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

发表于由

Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高等特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

 

储存条件

-25~-15℃避光保存，有效期18个月。

 

使用说明

  1. 推荐qPCR反应体系

组分

体积 （μL）***

体积 （μL）***

终浓度

Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)*

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)*

1

0.4

0.2 μM

模板DNA/cDNA**

x

x

–

无菌超纯水

Up to 50

Up to 20

–

表1 qPCR反应体系

*通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

**如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20-30个循环为宜。

***推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

 

  1. 反应程序

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

2 min

1

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸*

60℃

30 sec**

熔解曲线阶段*

仪器默认设置

1

表2 qPCR反应程序

*退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

**荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

***熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

 

适用机型

ABI：7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio1, 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon,Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR

 

引物设计指南

  1. 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。
  2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。
  3. 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
  4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
  5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物 3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
  6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

 

注意事项

  1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
  3. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11141ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
  4. 若需要电泳，为了获得清晰的条带，建议将qPCR产物稀释20-30倍后进行电泳。
  5. 本产品仅作科研用途！
Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

暂无内容

Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

暂无内容

 

Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高等特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

 

储存条件

-25~-15℃避光保存，有效期18个月。

 

使用说明

  1. 推荐qPCR反应体系

组分

体积 （μL）***

体积 （μL）***

终浓度

Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)*

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)*

1

0.4

0.2 μM

模板DNA/cDNA**

x

x

–

无菌超纯水

Up to 50

Up to 20

–

表1 qPCR反应体系

*通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

**如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20-30个循环为宜。

***推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

 

  1. 反应程序

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

2 min

1

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸*

60℃

30 sec**

熔解曲线阶段*

仪器默认设置

1

表2 qPCR反应程序

*退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

**荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast

31 sec：Applied Biosystems 7300

32 sec：Applied Biosystems 7500

***熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

 

适用机型

ABI：7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio1, 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon,Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0, Lightcycler 96;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR

 

引物设计指南

  1. 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。
  2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。
  3. 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
  4. 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
  5. 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物 3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
  6. 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

 

注意事项

  1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  2. 解冻后Master Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
  3. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11141ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
  4. 若需要电泳，为了获得清晰的条带，建议将qPCR产物稀释20-30倍后进行电泳。
  5. 本产品仅作科研用途！
Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

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Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix

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Hieff Trans® mRNA转染试剂(mRNA Transfection Reagent)

发表于由

Hieff Trans® mRNA转染试剂(mRNA Transfection Reagent)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff Trans® mRNA转染试剂是一款针对mRNA细胞转染的阳离子多聚物转染试剂，对常规细胞、原代细胞、神经细胞都具有较高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸–转染试剂复合物或更换新鲜培养基，也可根据细胞营养状态在4-6小时后更换新鲜培养基。

 

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品2-8ºC保存，一年有效。不可冷冻！

 

注意事项

1）转染操作时，以细胞融合度达70%-80%为佳，具体铺板密度根据细胞情况酌情而定。

2）制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释mRNA和转染试剂。

3）使用无RNA酶污染的耗材与试剂。

4）2-8ºC保存，要注意避免多次反复长时间开盖。

5）初次使用应优化核酸浓度和试剂量以得到最高的转染效率。

6）本产品仅作科研用途！

 

操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一）

注：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。

1. 细胞铺板，至转染操作时，以细胞融合度达70%-80%为佳。

2. 按照以下体系配制mRNA–转染试剂复合物：

1）对于每孔细胞，使用10 μL无血清培养基（如OPTI-MEM培养基）稀释0.4 μg mRNA，轻轻混匀。

2）对于每孔细胞，使用10 μL无血清培养基（如OPTI-MEM培养基）稀释0.8–1.6 μL转染试剂，轻轻混匀，室温孵育5 min。

3）将稀释的mRNA与稀释的转染试剂轻轻混匀。

4）室温静置孵育20 min。

3. 将mRNA-转染试剂复合物逐滴加到细胞中，轻轻混匀。

4. 37℃，5% CO2培养箱培养24-96 h，直至进行基因表达分析。

 

不同细胞培养容器转染用量（仅供参考）：

培养容器

表面积

每孔体积

mRNA转染

培养基体积

稀释液体积

mRNA

试剂体积

96-well

0.3 cm2

100 μL

2×5 μL

0.2 μg

0.2-0.4 μL

24-well

2 cm2

500 μL

2×10 μL

0.4 μg

0.8-1.6 μL

12-well

4 cm2

1 mL

2×20 μL

0.8 μg

1.6-3.2 μL

6-well

10 cm2

2 mL

2×50 μL

1 μg

2-4 μL

60-mm

20 cm2

5 mL

2×100 μL

4 μg

8-16 μL

10-cm

60 cm2

15 mL

2×300 μL

12 μg

24-48 μL

【注】该表使用量仅供参考，mRNA与转染试剂具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。建议使用时比值保持在1:0.5-1:5之间。

HB221102

Q：40809主要成分是PEI吗？

A：不是，是类似LNP的组分。

Hieff Trans® mRNA转染试剂(mRNA Transfection Reagent)

暂无内容

 

Hieff Trans® mRNA转染试剂是一款针对mRNA细胞转染的阳离子多聚物转染试剂，对常规细胞、原代细胞、神经细胞都具有较高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸–转染试剂复合物或更换新鲜培养基，也可根据细胞营养状态在4-6小时后更换新鲜培养基。

 

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。产品2-8ºC保存，一年有效。不可冷冻！

 

注意事项

1）转染操作时，以细胞融合度达70%-80%为佳，具体铺板密度根据细胞情况酌情而定。

2）制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释mRNA和转染试剂。

3）使用无RNA酶污染的耗材与试剂。

4）2-8ºC保存，要注意避免多次反复长时间开盖。

5）初次使用应优化核酸浓度和试剂量以得到最高的转染效率。

6）本产品仅作科研用途！

 

操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一）

注：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。

1. 细胞铺板，至转染操作时，以细胞融合度达70%-80%为佳。

2. 按照以下体系配制mRNA–转染试剂复合物：

1）对于每孔细胞，使用10 μL无血清培养基（如OPTI-MEM培养基）稀释0.4 μg mRNA，轻轻混匀。

2）对于每孔细胞，使用10 μL无血清培养基（如OPTI-MEM培养基）稀释0.8–1.6 μL转染试剂，轻轻混匀，室温孵育5 min。

3）将稀释的mRNA与稀释的转染试剂轻轻混匀。

4）室温静置孵育20 min。

3. 将mRNA-转染试剂复合物逐滴加到细胞中，轻轻混匀。

4. 37℃，5% CO2培养箱培养24-96 h，直至进行基因表达分析。

 

不同细胞培养容器转染用量（仅供参考）：

培养容器

表面积

每孔体积

mRNA转染

培养基体积

稀释液体积

mRNA

试剂体积

96-well

0.3 cm2

100 μL

2×5 μL

0.2 μg

0.2-0.4 μL

24-well

2 cm2

500 μL

2×10 μL

0.4 μg

0.8-1.6 μL

12-well

4 cm2

1 mL

2×20 μL

0.8 μg

1.6-3.2 μL

6-well

10 cm2

2 mL

2×50 μL

1 μg

2-4 μL

60-mm

20 cm2

5 mL

2×100 μL

4 μg

8-16 μL

10-cm

60 cm2

15 mL

2×300 μL

12 μg

24-48 μL

【注】该表使用量仅供参考，mRNA与转染试剂具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。建议使用时比值保持在1:0.5-1:5之间。

HB221102

Q：40809主要成分是PEI吗？

A：不是，是类似LNP的组分。

Hieff Trans® mRNA转染试剂(mRNA Transfection Reagent)

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Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）

发表于由

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）是一款采用公司新一代抗体法热启动Taq酶的荧光定量预混液。5× Mix预混合试剂包含反应缓冲液和酶mix，采用dUTP代替dTTP，并添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升多重qPCR反应扩增效率的因子，大大减少了非特异性PCR扩增和污染，能够保证引物效率的同时，进行多达四重的反应。本产品含有UDG酶，可有效防止气溶胶污染的风险。

 

组分信息

组分编号

组分名称

13891ES60

 (100 T)

13891ES80

(1000 T)

13891ES90

(5000 T)

13891ES92

(10000 T)

13891

5×TaqMan qPCR mix

500 μL

5 mL

25 mL

50 mL

 

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用说明

1.反应体系

组分

体积 (μL)

终浓度

5×TaqMan qPCR mix

5

1×

Primer mix (10 μM)

X

0.1-0.5 μM

Probe mix (10 μM)

X

50-250 nM

模板

1-10

–

ddH2O

up to 25

–

2.适用机型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex;

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Stratagene: MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.  

3.参考扩增程序

循环步骤

温度

时间

循环数

污染降解

37°C

5 min

1

预变性

97°C

30 s

1

变性

97°C

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）3 s

45

退火/延伸*

60°C

15 s

*退火/延伸温度可根据实验要求适当调整。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

Ver.CN20230526

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）

暂无内容

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）

暂无内容

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）是一款采用公司新一代抗体法热启动Taq酶的荧光定量预混液。5× Mix预混合试剂包含反应缓冲液和酶mix，采用dUTP代替dTTP，并添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升多重qPCR反应扩增效率的因子，大大减少了非特异性PCR扩增和污染，能够保证引物效率的同时，进行多达四重的反应。本产品含有UDG酶，可有效防止气溶胶污染的风险。

 

组分信息

组分编号

组分名称

13891ES60

 (100 T)

13891ES80

(1000 T)

13891ES90

(5000 T)

13891ES92

(10000 T)

13891

5×TaqMan qPCR mix

500 μL

5 mL

25 mL

50 mL

 

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用说明

1.反应体系

组分

体积 (μL)

终浓度

5×TaqMan qPCR mix

5

1×

Primer mix (10 μM)

X

0.1-0.5 μM

Probe mix (10 μM)

X

50-250 nM

模板

1-10

–

ddH2O

up to 25

–

2.适用机型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500, 7500 Fast, ViiA™7, QuantStudio™ 3 and 5, QuantStudio™ 6,7,12k Flex;

Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;

Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;

Stratagene: MX3000P™, MX3005P™, MX4000P™;

Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.  

3.参考扩增程序

循环步骤

温度

时间

循环数

污染降解

37°C

5 min

1

预变性

97°C

30 s

1

变性

97°C

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）3 s

45

退火/延伸*

60°C

15 s

*退火/延伸温度可根据实验要求适当调整。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

 

Ver.CN20230526

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）

暂无内容

Hieff Unicon® Universal TaqMan Multiplex qPCR Master Mix（UDG plus）

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Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

发表于由

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析（如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等），无需提RNA，可直接进行qPCR表达分析，用时短，操作简单，出错率低，最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的荧光定量qPCR模块，为补充试剂。

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*，5000 rpm离心2 min收集细胞**，充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养，可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗细胞，5000 rpm离心2 min，吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室温吸打混匀后静置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右，即可得到裂解产物****，细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells，若细胞数量较多，可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同，请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要，加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时，请置于-25~-15℃。

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配置反应体系：

组分

体积 （μL）

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

1×

裂解产物*

x

–

RNase-free H2O

Up to 20

–

表1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片，推荐使用量为2 μl，最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行反转录反应**：

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

表2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃，反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制，得到合适的Ct值（10-35），可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-25~-15℃保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液（配制过程请于冰上进行）：

组分

体积（μL）

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

1×

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

–

RNase-free H2O

Up to 25

–

表3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增，可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序（推荐）

本产品推荐使用快速程序扩增，可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时，可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

表4 qPCR反应程序（快速）

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时，也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

表5 qPCR反应程序（常规）

 

注意事项

  1. 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途！

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

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Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

暂无内容

 

Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析（如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等），无需提RNA，可直接进行qPCR表达分析，用时短，操作简单，出错率低，最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的荧光定量qPCR模块，为补充试剂。

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存，有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化，使用前上下颠倒，轻轻混匀，并轻微离心后使用，避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*，5000 rpm离心2 min收集细胞**，充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养，可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗细胞，5000 rpm离心2 min，吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液，2 μL DNase I溶液，室温吸打混匀后静置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右，即可得到裂解产物****，细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells，若细胞数量较多，可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同，请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要，加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时，请置于-25~-15℃。

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀，置于冰上并按下表配置反应体系：

组分

体积 （μL）

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

1×

裂解产物*

x

–

RNase-free H2O

Up to 20

–

表1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片，推荐使用量为2 μl，最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行反转录反应**：

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

表2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃，反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制，得到合适的Ct值（10-35），可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验，可放置于-25~-15℃保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液（配制过程请于冰上进行）：

组分

体积（μL）

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

1×

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

–

RNase-free H2O

Up to 25

–

表3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增，可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时，可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序（推荐）

本产品推荐使用快速程序扩增，可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时，可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

表4 qPCR反应程序（快速）

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因，个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时，也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

表5 qPCR反应程序（常规）

 

注意事项

  1. 使用前，将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时，请尽量使用无污染的耗材，避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融，配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途！

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

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Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4

发表于由

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述
   Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量文库构建专用配套试剂盒，共分为4个Set，每个Set中包含12种不同的Barcode接头，适用于Illumina®高通量测序平台多样品DNA文库构建。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度保证了文库构建的稳定性和可重复性。

产品组分

编号

组分

产品规格

12×4T

12×16 T

12615

DNA Adapter 1-12

12 μL each

48 uL each

12616

DNA Adapter 13-24

12 μL each

48 uL each

12617

DNA Adapter 25-36

12 μL each

48 uL each

12618

DNA Adapter 37-48

12 μL each

48 uL each

运输和保存方法

冰袋运输，-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）本试剂盒中DNA Adapter的浓度统一为15 μM，单个文库构建的接头使用量根据所用试剂盒进行调整。

2）切勿加热接头，应在室温让其缓慢溶解，实验室温度最好设置为20-25℃。接头避免反复冻融，可短暂存放于4℃。

3）小规格试剂盒（12×4 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行4个DNA文库构建，共计足够进行48个DNA文库构建，大规格试剂盒（12×16 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行16个DNA文库构建，共计足够进行192个DNA文库构建。

4）使用Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®试剂盒构建的DNA文库结构如下：

   5’ – Universal Adapter – Insert DNA Sequence – DNA Barcode Adapter- 3’

5）试剂盒中提供的每种DNA Adapter中都包含Universal Adapter，且提供一种Barcode序列标签，用于高通量测序时区分样品。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7）本产品仅作科研用途！

使用方法

DNA Adapter的序列如下：

Universal Adapter：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

Barcode Adapter：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXX1ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

1XXXXXX表示接头的Barcode区域，其在每个接头中的序列见下表。测序前在Sample Sheet中只需输入这个Barcode序列（6 bp）即可。

名称

序列

  

名称

序列

DNA Adapter 1

CGATGT

  

DNA Adapter 25

ACTGAT

DNA Adapter 2

TGACCA

  

DNA Adapter 26

ATGAGC

DNA Adapter 3

ACAGTG

  

DNA Adapter 27

ATTCCT

DNA Adapter 4

GCCAAT

  

DNA Adapter 28

CAAAAG

DNA Adapter 5

CAGATC

  

DNA Adapter 29

CAACTA

DNA Adapter 6

CTTGTA

  

DNA Adapter 30

CACCGG

DNA Adapter 7

ATCACG

  

DNA Adapter 31

CACGAT

DNA Adapter 8

TTAGGC

  

DNA Adapter 32

CACTCA

DNA Adapter 9

ACTTGA

  

DNA Adapter 33

CAGGCG

DNA Adapter 10

GATCAG

  

DNA Adapter 34

CATGGC

DNA Adapter 11

TAGCTT

  

DNA Adapter 35

CATTTT

DNA Adapter 12

GGCTAC

  

DNA Adapter 36

CCAACA

DNA Adapter 13

AGTCAA

  

DNA Adapter 37

CGGAAT

DNA Adapter 14

AGTTCC

  

DNA Adapter 38

CTAGCT

DNA Adapter 15

ATGTCA

  

DNA Adapter 39

CTATAC

DNA Adapter 16

CCGTCC

  

DNA Adapter 40

CTCAGA

DNA Adapter 17

GTAGAG

  

DNA Adapter 41

GCGCTA

DNA Adapter 18

GTCCGC

  

DNA Adapter 42

TAATCG

DNA Adapter 19

GTGAAA

  

DNA Adapter 43

TACAGC

DNA Adapter 20

GTGGCC

  

DNA Adapter 44

TATAAT

DNA Adapter 21

GTTTCG

  

DNA Adapter 45

TCATTC

DNA Adapter 22

CGTACG

  

DNA Adapter 46

TCCCGA

DNA Adapter 23

GAGTGG

  

DNA Adapter 47

TCGAAG

DNA Adapter 24

GGTAGC

  

DNA Adapter 48

TCGGCA

推荐Barcode组合：

2个样本：可使用（4, 6）、或（3, 19）。

3个样本：可使用（4, 6, 其他任意1个barcode）、或（3, 19, 其他任意1个barcode）、或（1, 5, 19）、或（3, 12, 15）等。

4个样本：可使用（4, 6, 其他任意2个barcode）、或（3, 19, 其他任意2个barcode）、或（3, 4, 6, 19）、或（1, 2, 5, 16）等。

 

质量控制
 

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4
图. 接头Agilent 2100检测图。

相关产品

接头类型

货号

名称

规格

价格（元）

短接头

单端

96 Index

12611ES02

Hieff NGS®  96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 1（48种）

48×2 T

1493

12612ES02

Hieff NGS®  96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 2（48种）

48×2 T

1493

双端

384 Index

12613ES02

Hieff NGS®   384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 1（96 种）

96×2 T

2753

12614ES02

Hieff NGS®  384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 2（96 种）

96×2 T

2753

完整接头

12615ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1

12×4/

12×16 T

1256/4526

12616ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2

12×4/

12×16 T

1256/4536

12617ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3

12×4/

12×16 T

1256/4536

12618ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4

12×4/

12×16 T

1256/4536

Tn5接头

12610ES96

Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®(96 Index)

96 T

1365

 

HB220530

 

Q：构建得到的文库产量低的原因？

A：1、DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等）

Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及 A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。

2、RNA 污染

样本中存在RNA 污染会导致DNA 定量不准确，使文库构建时DNA 上样量不足。

3、PCR free 的时候上样量不足

当使用完整接头且Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直接测序，可在接头连接完成后对DNA 文库进行PCR 扩增。

4、接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。

判断接头是否降解的方法：

a.用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。

b.用Qubit、酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。

检测方法：取 1uL，15uM 的complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。

Q：最后一步扩增，短接头中Primer 和长接头的Primer 是否一致？

A：不一致。短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头 PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的DNA 文库。长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物 Primer Mix 扩增完整的文库，使用长接头时，若在PCR 扩增之前文库浓度就达到上机要求，则无需进行PCR 文库扩增。

Q：接头中index/Barcode 组合原则是什么？

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4A：碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文 一文全面解析 NGS 接头的奥秘 ）

 

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4

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   Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量文库构建专用配套试剂盒，共分为4个Set，每个Set中包含12种不同的Barcode接头，适用于Illumina®高通量测序平台多样品DNA文库构建。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度保证了文库构建的稳定性和可重复性。

产品组分

编号

组分

产品规格

12×4T

12×16 T

12615

DNA Adapter 1-12

12 μL each

48 uL each

12616

DNA Adapter 13-24

12 μL each

48 uL each

12617

DNA Adapter 25-36

12 μL each

48 uL each

12618

DNA Adapter 37-48

12 μL each

48 uL each

运输和保存方法

冰袋运输，-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）本试剂盒中DNA Adapter的浓度统一为15 μM，单个文库构建的接头使用量根据所用试剂盒进行调整。

2）切勿加热接头，应在室温让其缓慢溶解，实验室温度最好设置为20-25℃。接头避免反复冻融，可短暂存放于4℃。

3）小规格试剂盒（12×4 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行4个DNA文库构建，共计足够进行48个DNA文库构建，大规格试剂盒（12×16 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行16个DNA文库构建，共计足够进行192个DNA文库构建。

4）使用Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®试剂盒构建的DNA文库结构如下：

   5’ – Universal Adapter – Insert DNA Sequence – DNA Barcode Adapter- 3’

5）试剂盒中提供的每种DNA Adapter中都包含Universal Adapter，且提供一种Barcode序列标签，用于高通量测序时区分样品。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7）本产品仅作科研用途！

使用方法

DNA Adapter的序列如下：

Universal Adapter：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

Barcode Adapter：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXX1ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

1XXXXXX表示接头的Barcode区域，其在每个接头中的序列见下表。测序前在Sample Sheet中只需输入这个Barcode序列（6 bp）即可。

名称

序列

  

名称

序列

DNA Adapter 1

CGATGT

  

DNA Adapter 25

ACTGAT

DNA Adapter 2

TGACCA

  

DNA Adapter 26

ATGAGC

DNA Adapter 3

ACAGTG

  

DNA Adapter 27

ATTCCT

DNA Adapter 4

GCCAAT

  

DNA Adapter 28

CAAAAG

DNA Adapter 5

CAGATC

  

DNA Adapter 29

CAACTA

DNA Adapter 6

CTTGTA

  

DNA Adapter 30

CACCGG

DNA Adapter 7

ATCACG

  

DNA Adapter 31

CACGAT

DNA Adapter 8

TTAGGC

  

DNA Adapter 32

CACTCA

DNA Adapter 9

ACTTGA

  

DNA Adapter 33

CAGGCG

DNA Adapter 10

GATCAG

  

DNA Adapter 34

CATGGC

DNA Adapter 11

TAGCTT

  

DNA Adapter 35

CATTTT

DNA Adapter 12

GGCTAC

  

DNA Adapter 36

CCAACA

DNA Adapter 13

AGTCAA

  

DNA Adapter 37

CGGAAT

DNA Adapter 14

AGTTCC

  

DNA Adapter 38

CTAGCT

DNA Adapter 15

ATGTCA

  

DNA Adapter 39

CTATAC

DNA Adapter 16

CCGTCC

  

DNA Adapter 40

CTCAGA

DNA Adapter 17

GTAGAG

  

DNA Adapter 41

GCGCTA

DNA Adapter 18

GTCCGC

  

DNA Adapter 42

TAATCG

DNA Adapter 19

GTGAAA

  

DNA Adapter 43

TACAGC

DNA Adapter 20

GTGGCC

  

DNA Adapter 44

TATAAT

DNA Adapter 21

GTTTCG

  

DNA Adapter 45

TCATTC

DNA Adapter 22

CGTACG

  

DNA Adapter 46

TCCCGA

DNA Adapter 23

GAGTGG

  

DNA Adapter 47

TCGAAG

DNA Adapter 24

GGTAGC

  

DNA Adapter 48

TCGGCA

推荐Barcode组合：

2个样本：可使用（4, 6）、或（3, 19）。

3个样本：可使用（4, 6, 其他任意1个barcode）、或（3, 19, 其他任意1个barcode）、或（1, 5, 19）、或（3, 12, 15）等。

4个样本：可使用（4, 6, 其他任意2个barcode）、或（3, 19, 其他任意2个barcode）、或（3, 4, 6, 19）、或（1, 2, 5, 16）等。

 

质量控制
 

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图. 接头Agilent 2100检测图。

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单端

96 Index

12611ES02

Hieff NGS®  96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 1（48种）

48×2 T

1493

12612ES02

Hieff NGS®  96 Single Index Primer Kit for Illumina® , Set 2（48种）

48×2 T

1493

双端

384 Index

12613ES02

Hieff NGS®   384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 1（96 种）

96×2 T

2753

12614ES02

Hieff NGS®  384 Dual Index Primer Kit for Illumina® ，Set 2（96 种）

96×2 T

2753

完整接头

12615ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1

12×4/

12×16 T

1256/4526

12616ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2

12×4/

12×16 T

1256/4536

12617ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3

12×4/

12×16 T

1256/4536

12618ES04/16

Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4

12×4/

12×16 T

1256/4536

Tn5接头

12610ES96

Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina®(96 Index)

96 T

1365

 

HB220530

 

Q：构建得到的文库产量低的原因？

A：1、DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等）

Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及 A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。

2、RNA 污染

样本中存在RNA 污染会导致DNA 定量不准确，使文库构建时DNA 上样量不足。

3、PCR free 的时候上样量不足

当使用完整接头且Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直接测序，可在接头连接完成后对DNA 文库进行PCR 扩增。

4、接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。

判断接头是否降解的方法：

a.用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。

b.用Qubit、酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。

检测方法：取 1uL，15uM 的complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。

Q：最后一步扩增，短接头中Primer 和长接头的Primer 是否一致？

A：不一致。短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头 PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的DNA 文库。长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物 Primer Mix 扩增完整的文库，使用长接头时，若在PCR 扩增之前文库浓度就达到上机要求，则无需进行PCR 文库扩增。

Q：接头中index/Barcode 组合原则是什么？

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4A：碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文 一文全面解析 NGS 接头的奥秘 ）

 

Hieff NGS®高通量文库构建专用配套试剂盒set4|Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®,Set 4

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NGS新型DNA连接模块|Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module

发表于由

NGS新型DNA连接模块|Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module是针对Illumina®与MGI®高通量测序平台文库构建专业设计的DNA连接模块，采用一款我公司自主研发的新型连接酶Novel T4 DNA ligase。本产品可在双链平末端DNA片段或双链3´-dA DNA片段的两端连接Illumina®与MGI®测序平台适用的DNA接头，具有高效的连接能力，兼容各类样本，同时也适用于自动化平台，对于复杂结构核酸片段的连接更显优势，均可得到优异的测序质量。本产品与Hieff NGS® Ultima Endperp Mix（Cat#12605），2×Super Canace® II High-Fidelity Mix for Library Amplification（Cat#12621）共同用于DNA文库构建，通过Illumina®高通量平台测序已验证其有效性。本产品与Hieff NGS® Ultima Endperp Mix（Cat#12605），2×Novel HF Amplification Mix for MGI®（Cat#13344）共同用于DNA文库构建，通过MGI®高通量平台测序已验证其有效性。本产品中提供的所有试剂组分，都经过严格的质量与功能验证，最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

 

产品组分

产品编号

组分名称

产品编号/规格

12626ES24

12626ES96

12626-A

Novel T4 DNA Ligase

120 μL

480 μL

12626-B

5×Novel Ligation Buffer

480 μL

2×960 μL

 

运输与保存方法

冰袋运输。

-20℃保存，效期18个月。

 

注意事项

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.本产品仅用作科研用途！

 

使用方法

1. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表1  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

Input DNA

Adapter : Input DNA摩尔比

Input DNA

Adapter : Input DNA摩尔比

1 μg

10:1

50 ng

100:1

500 ng

20:1

25 ng

200:1

250 ng

40:1

1 ng

200:1

100 ng

100:1

500 pg

400:1

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

2. 目前主流的合并法DNA建库试剂盒，其末端修复和加A处理后一般不纯化，直接进行接头连接。本试剂盒可与主流的商业化末端修复加A体系兼容，进行接头连接。反应体系请参考如下配制，涡旋瞬离后置于20℃，反应15分钟即可。

表2  Adapter Ligation体系

名称

体积（μL）

dA-tailed DNA

60

5×Novel Ligation Buffer

20*

Novel T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

X**

ddH2O

To 100

【注】：*对于5×Novel Ligation Buffer，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**根据自身需求加入适量的接头。

【接头添加计算举例】：

当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步，计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]；

Input DNA 摩尔数（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步，计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表2查询接头添加比例；

根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数（50 pmol）÷接头浓度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

综上，接头可添加3.4 μL，加1.6 μL水补齐至5 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）

HB220829

 

Q：12626 产品连接buffer 比较粘稠，如果不混匀会造成什么影响？

A：连接反应混合不当，可能导致文库产量低。为了保证合适的混合，反应可以上下颠倒 10 次，或者

漩涡 3 秒。

 

NGS新型DNA连接模块|Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module

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Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module是针对Illumina®与MGI®高通量测序平台文库构建专业设计的DNA连接模块，采用一款我公司自主研发的新型连接酶Novel T4 DNA ligase。本产品可在双链平末端DNA片段或双链3´-dA DNA片段的两端连接Illumina®与MGI®测序平台适用的DNA接头，具有高效的连接能力，兼容各类样本，同时也适用于自动化平台，对于复杂结构核酸片段的连接更显优势，均可得到优异的测序质量。本产品与Hieff NGS® Ultima Endperp Mix（Cat#12605），2×Super Canace® II High-Fidelity Mix for Library Amplification（Cat#12621）共同用于DNA文库构建，通过Illumina®高通量平台测序已验证其有效性。本产品与Hieff NGS® Ultima Endperp Mix（Cat#12605），2×Novel HF Amplification Mix for MGI®（Cat#13344）共同用于DNA文库构建，通过MGI®高通量平台测序已验证其有效性。本产品中提供的所有试剂组分，都经过严格的质量与功能验证，最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

 

产品组分

产品编号

组分名称

产品编号/规格

12626ES24

12626ES96

12626-A

Novel T4 DNA Ligase

120 μL

480 μL

12626-B

5×Novel Ligation Buffer

480 μL

2×960 μL

 

运输与保存方法

冰袋运输。

-20℃保存，效期18个月。

 

注意事项

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.本产品仅用作科研用途！

 

使用方法

1. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表1  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

Input DNA

Adapter : Input DNA摩尔比

Input DNA

Adapter : Input DNA摩尔比

1 μg

10:1

50 ng

100:1

500 ng

20:1

25 ng

200:1

250 ng

40:1

1 ng

200:1

100 ng

100:1

500 pg

400:1

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

2. 目前主流的合并法DNA建库试剂盒，其末端修复和加A处理后一般不纯化，直接进行接头连接。本试剂盒可与主流的商业化末端修复加A体系兼容，进行接头连接。反应体系请参考如下配制，涡旋瞬离后置于20℃，反应15分钟即可。

表2  Adapter Ligation体系

名称

体积（μL）

dA-tailed DNA

60

5×Novel Ligation Buffer

20*

Novel T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

X**

ddH2O

To 100

【注】：*对于5×Novel Ligation Buffer，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**根据自身需求加入适量的接头。

【接头添加计算举例】：

当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步，计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]；

Input DNA 摩尔数（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步，计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表2查询接头添加比例；

根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数（50 pmol）÷接头浓度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

综上，接头可添加3.4 μL，加1.6 μL水补齐至5 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）

HB220829

 

Q：12626 产品连接buffer 比较粘稠，如果不混匀会造成什么影响？

A：连接反应混合不当，可能导致文库产量低。为了保证合适的混合，反应可以上下颠倒 10 次，或者

漩涡 3 秒。

 

NGS新型DNA连接模块|Hieff NGS® Novel DNA Ligation Module

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常见细胞系转染试剂 Hieff Trans® 293 Transfection Reagent

发表于由

常见细胞系转染试剂 Hieff Trans® 293 Transfection Reagent

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff Trans® 常见细胞系转染试剂是一种高性能阳离子聚合物转染试剂，适用于常见贴壁或悬浮的多种细胞的质粒DNA转染，包括HEK293，MCF-7，RAW 264.7，HUVEC，HBE，THP-1，PC-3，A549，Hela，BJ，U-87 MG，Caco-2等。Hieff Trans® 常见细胞系转染试剂经过精心设计，结构明确、分子量均一，可实现高效、高重复性的细胞转染使其兼具优异的阳离子聚合物转染试剂/DNA复合物形成能力和转染到细胞内DNA的快速释放能力，保证了优异的转染性能和极低的细胞毒性。

 

产品信息

货号

40817ES03 / 40817ES10

规格

1 mL / 10 mL

 

组分信息

组分编码

组分名称

40817ES03

40817ES10

40817

Hieff Trans® 常见细胞系转染试剂

1 mL

10 mL

 

储存条件

2-8ºC保存，有效期2年。

 

使用说明

以6孔板贴壁培养HEK 293T为例

1. 接种细胞

根据细胞状态，选择合适的接种密度，以转染时细胞密度在70%~80%为宜。

2. 准备DNA-转染试剂复合物

2.1 质粒与试剂比例：建议质粒（μg）与试剂（μL）参考配比区间为1:0.5 ~ 1:3。

2.2 质粒稀释：使用50 μL无血清培养基稀释2 μg质粒，并轻轻混匀。

2.3 试剂稀释：使用50 μL无血清培养基稀释4 μL 转染试剂，并轻轻混匀。

2.4 配置复合物：将配置好的试剂稀释液加入到质粒稀释液中，轻轻涡旋混匀后，室温静置10-20 min，备用。

3. 转染细胞

3.1 直接将配置好的DNA-转染试剂复合物加入到细胞培养板的每个孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

3.2 在37℃，5% CO2培养箱中培养24-72h后进行检测分析。

不同细胞培养容器转染用量（仅供参考）：

培养容器

表面积（cm2）

DNA稀释

转染试剂稀释

培养基总量

DNA量（μg）

稀释液体积（μL）

转染试剂量（μL）

稀释液体积（μL）

96孔板

0.3

0.1

5

0.2

5

100 μL

48孔板

0.7

0.2

10

0.4

10

200 μL

24孔板

1.9

0.5

25

1

25

500 μL

12孔板

3.8

1

25

2

25

1 mL

6孔板

10

2

50

4

50

2 mL

25 cm2培养瓶

21

4

100

8

100

4 mL

75 cm2培养瓶

58

8

250

16

250

10 mL

10 cm2培养皿

60

8

250

16

250

10 mL

 

注意事项

1. 转染过程中推荐使用高质量的质粒，如不含内毒素的质粒。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套及通风橱操作。

3. 本产品仅用于科研用途，不可用于人体。

 

Ver.CN20230522

常见细胞系转染试剂 Hieff Trans® 293 Transfection Reagent

暂无内容

常见细胞系转染试剂 Hieff Trans® 293 Transfection Reagent

暂无内容

 

Hieff Trans® 常见细胞系转染试剂是一种高性能阳离子聚合物转染试剂，适用于常见贴壁或悬浮的多种细胞的质粒DNA转染，包括HEK293，MCF-7，RAW 264.7，HUVEC，HBE，THP-1，PC-3，A549，Hela，BJ，U-87 MG，Caco-2等。Hieff Trans® 常见细胞系转染试剂经过精心设计，结构明确、分子量均一，可实现高效、高重复性的细胞转染使其兼具优异的阳离子聚合物转染试剂/DNA复合物形成能力和转染到细胞内DNA的快速释放能力，保证了优异的转染性能和极低的细胞毒性。

 

产品信息

货号

40817ES03 / 40817ES10

规格

1 mL / 10 mL

 

组分信息

组分编码

组分名称

40817ES03

40817ES10

40817

Hieff Trans® 常见细胞系转染试剂

1 mL

10 mL

 

储存条件

2-8ºC保存，有效期2年。

 

使用说明

以6孔板贴壁培养HEK 293T为例

1. 接种细胞

根据细胞状态，选择合适的接种密度，以转染时细胞密度在70%~80%为宜。

2. 准备DNA-转染试剂复合物

2.1 质粒与试剂比例：建议质粒（μg）与试剂（μL）参考配比区间为1:0.5 ~ 1:3。

2.2 质粒稀释：使用50 μL无血清培养基稀释2 μg质粒，并轻轻混匀。

2.3 试剂稀释：使用50 μL无血清培养基稀释4 μL 转染试剂，并轻轻混匀。

2.4 配置复合物：将配置好的试剂稀释液加入到质粒稀释液中，轻轻涡旋混匀后，室温静置10-20 min，备用。

3. 转染细胞

3.1 直接将配置好的DNA-转染试剂复合物加入到细胞培养板的每个孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

3.2 在37℃，5% CO2培养箱中培养24-72h后进行检测分析。

不同细胞培养容器转染用量（仅供参考）：

培养容器

表面积（cm2）

DNA稀释

转染试剂稀释

培养基总量

DNA量（μg）

稀释液体积（μL）

转染试剂量（μL）

稀释液体积（μL）

96孔板

0.3

0.1

5

0.2

5

100 μL

48孔板

0.7

0.2

10

0.4

10

200 μL

24孔板

1.9

0.5

25

1

25

500 μL

12孔板

3.8

1

25

2

25

1 mL

6孔板

10

2

50

4

50

2 mL

25 cm2培养瓶

21

4

100

8

100

4 mL

75 cm2培养瓶

58

8

250

16

250

10 mL

10 cm2培养皿

60

8

250

16

250

10 mL

 

注意事项

1. 转染过程中推荐使用高质量的质粒，如不含内毒素的质粒。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套及通风橱操作。

3. 本产品仅用于科研用途，不可用于人体。

 

Ver.CN20230522

常见细胞系转染试剂 Hieff Trans® 293 Transfection Reagent

暂无内容

常见细胞系转染试剂 Hieff Trans® 293 Transfection Reagent

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2×实时定量PCR扩增预混液|Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法,Low Rox)

发表于由

2×实时定量PCR扩增预混液|Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix(抗体法,Low Rox)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品简介

 

本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶（货号：10113ES），在预变性温度（95℃）加热30sec，UNICON® Taq抗体失活，释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时，配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适合低浓度模板的扩增，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。

Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及Low Rox。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

 

产品信息

 

货号

11199ES03 / 11199ES08 / 11199ES25 / 11199ES50 / 11199ES60

规格

1 mL / 5×1 mL / 5×5 mL / 10×5 mL / 20×5 mL

 

储存条件

 

-25~-15℃避光保存，有效期18个月。本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。  

 

使用说明

 

  1. 反应体系（推荐冰上配制）

组分

体积 (μL)****

体积 (μL)

终浓度

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，Low Rox)*

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)**

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)**

1

0.4

0.2 μM

模板DNA***

X

X

–

RNase Free H2O

to 50

to 20

–

*使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

**通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

***如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

****推荐使用20 μL或50 μL总体积，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

  1. 扩增程序*
  1. 两步法

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性**

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸***

60℃

30 sec****

熔解曲线阶段*****

仪器默认设置

1

2）三步法

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性**

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

退火***

55-60℃

20 sec

延伸

72℃

20 sec****

熔解曲线阶段*****

仪器默认设置

1

*高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

**预变性时间可根据不同模板和引物的具体情况适当增加至3-5 min。

***退火温度和时间请根据引物和目的基因的长度进行调整。

****荧光信号采集请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

*****熔解曲线通常情况下可以使用仪器默认程序。

  1. 结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1）扩增曲线

  1. Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；
  2. Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
  3. Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
  4. Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2）熔解曲线

a.   熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

b.   熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

c.   如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

d.   如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

  1. 引物设计指南

1） 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2） 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3)  引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4)  引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5)  引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6)  设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

5. 适用机型

Applied Biosystems: 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio Dx, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000.

 

注意事项

 

  1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（Cat#11141），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
  2. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质，4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
  3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  4. 本产品仅作科研用途。

 

Ver.CN20231128

 

Q1:模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A:(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5–10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在  20–30  之间的最佳上样量。

(2)常用的量是逆转录 500–1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。

Q2:qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A🙁1)有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90–110%，对应斜率为-3–3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。
（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。
（3） 熔解曲线：为单一峰。(2)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

Q3:Rox 的作用？

A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

Q4:为什么扩增曲线不稳定（扩增曲线平台期锯齿状）？
A:可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8–2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。

b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪器算法错误，导致各种异常结果。

解决方案：a）先梯度加大模板稀释倍数看优化效果。若效果仍不好建议新制备高纯度RNA 重新实验。

b） 定期（一般 1 年）进行仪器校准保养。

Q5:为什么扩增曲线无法达到平台期？

A:可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如  Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。
b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。
c） 试剂扩增效率低（CT 小，但无法达到平台期，曲线比较“趴”）。
解决方案：a）提高模板量；参考 Q1 的优化方法。

b）提高循环次数；推荐循环数：一般 40。低丰度基因可设 45。
c）做标准曲线测定扩增效率，若确实偏低，则换试剂。

d）增加 Mg2+浓度（会增加非特异扩增）

Q6:为什么出现双峰，并且较低峰 Tm 在 80℃之前？

A:较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度过低或引物浓度过高。

解决方案：a）适当提高退火温度； b）提高模板量，降低引物浓度； c）重新设计引物。

Q7:为什么出现双峰，双峰 Tm 都在 80℃以前？

A:双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。

优化方法：提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。Q8:为什么出现双峰，并且双峰Tm 都在 80℃以后？

A:可能原因：a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。
b）交叉污染。

c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。

解决方案：a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。
b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。

c）通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

Q9:为什么是单峰，但 Tm 在 80℃之前？

A:可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。

注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现双峰）。

解决方案：进行高分辨率琼脂糖电泳，检测有无目的条带，以确定模板是否加入。优化方法：新配制无误的反应体系，重新实验。

Q10:为什么是单峰，但峰不尖锐？

A:可能原因：存在大小相近的非特异性扩增

解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；

b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

[1] Qin Q, Shou J, Li M, et al. Stk24 protects against obesity-associated metabolic disorders by disrupting the NLRP3 inflammasome. Cell Rep. 2021;35(8):109161. doi:10.1016/j.celrep.2021.109161(IF:9.423)
[2] Wu S, Guo X, Zhou J, et al. High expression of UNC5B enhances tumor proliferation, increases metastasis, and worsens prognosis in breast cancer [published online ahead of print, 2020 Sep 9]. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17079-17098. doi:10.18632/aging.103639(IF:5.682)
[3] Chen Y, Huang X, Zhu K, et al. LIMD2 is a Prognostic and Predictive Marker in Patients With Esophageal Cancer Based on a ceRNA Network Analysis. Front Genet. 2021;12:774432. Published 2021 Nov 18. doi:10.3389/fgene.2021.774432(IF:4.599)
[4] Pan J, Ren Q, Yang Z, et al. The effect of melatonin on the mouse ameloblast-lineage cell line ALCs. Sci Rep. 2022;12(1):8225. Published 2022 May 17. doi:10.1038/s41598-022-11912-3(IF:4.380)
[5] Li W, Zhang Z, Zhang L, et al. Antiviral Role of Serine Incorporator 5 (SERINC5) Proteins in Classical Swine Fever Virus Infection. Front Microbiol. 2020;11:580233. Published 2020 Sep 4. doi:10.3389/fmicb.2020.580233(IF:4.236)
[6] Hu F, Li C, Zheng X, et al. Lung adenocarcinoma resistance to therapy with EGFR‑tyrosine kinase inhibitors is related to increased expression of cancer stem cell markers SOX2, OCT4 and NANOG. Oncol Rep. 2020;43(2):727-735. doi:10.3892/or.2019.7454(IF:3.417)
[7] Zhao Y, Castro LFC, Monroig Ó, Cao X, Sun Y, Gao J. A zebrafish pparγ gene deletion reveals a protein kinase network associated with defective lipid metabolism [published online ahead of print, 2022 Mar 15]. Funct Integr Genomics. 2022;10.1007/s10142-022-00839-7. doi:10.1007/s10142-022-00839-7(IF:3.410)
[8] Zhang H, Yang X, Hu F, et al. Expression Level of Wnt5a Was Related to the Therapeutic Effects of First-Generation EGFR-TKIs. Onco Targets Ther. 2020;13:5387-5394. Published 2020 Jun 11. doi:10.2147/OTT.S250024(IF:3.337)
[9] Xie J, Cai Z, Zheng W, Zhang H. Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles in response to gut microbiota depletion in the abdomens of female Bactrocera dorsalis [published online ahead of print, 2022 Jun 25]. Insect Sci. 2022;10.1111/1744-7917.13091. doi:10.1111/1744-7917.13091(IF:3.262)

产品简介

 

本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。采用的抗体法热启动DNA聚合酶（货号：10113ES），在预变性温度（95℃）加热30sec，UNICON® Taq抗体失活，释放出Taq DNA Polymerase活性。抗体法热启动Taq酶可以有效抑制引物非特异性退火导致的扩增。同时，配方优化了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子，适合低浓度模板的扩增，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的标准曲线。

Mix中含有Hieff® Taq DNA Polymerase、UNICON® Taq抗体、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及Low Rox。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

 

产品信息

 

货号

11199ES03 / 11199ES08 / 11199ES25 / 11199ES50 / 11199ES60

规格

1 mL / 5×1 mL / 5×5 mL / 10×5 mL / 20×5 mL

 

储存条件

 

-25~-15℃避光保存，有效期18个月。本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。  

 

使用说明

 

  1. 反应体系（推荐冰上配制）

组分

体积 (μL)****

体积 (μL)

终浓度

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，Low Rox)*

25

10

1×

Forward Primer (10 μM)**

1

0.4

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)**

1

0.4

0.2 μM

模板DNA***

X

X

–

RNase Free H2O

to 50

to 20

–

*使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

**通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

***如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

****推荐使用20 μL或50 μL总体积，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

  1. 扩增程序*
  1. 两步法

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性**

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

退火/延伸***

60℃

30 sec****

熔解曲线阶段*****

仪器默认设置

1

2）三步法

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性**

95℃

30 sec

1

变性

95℃

10 sec

40

退火***

55-60℃

20 sec

延伸

72℃

20 sec****

熔解曲线阶段*****

仪器默认设置

1

*高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

**预变性时间可根据不同模板和引物的具体情况适当增加至3-5 min。

***退火温度和时间请根据引物和目的基因的长度进行调整。

****荧光信号采集请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：

30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

*****熔解曲线通常情况下可以使用仪器默认程序。

  1. 结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1）扩增曲线

  1. Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；
  2. Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；
  3. Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；
  4. Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2）熔解曲线

a.   熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

b.   熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

c.   如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

d.   如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

  1. 引物设计指南

1） 推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，可以在100 bp-300 bp内选择。

2） 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3)  引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4)  引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5)  引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6)  设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

5. 适用机型

Applied Biosystems: 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio Dx, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000.

 

注意事项

 

  1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（Cat#11141），以有效去除RNA样品中残留的基因组。
  2. 解冻后Master Mix可能出现絮状物质，4℃放置并上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
  3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
  4. 本产品仅作科研用途。

 

Ver.CN20231128

 

Q1:模板用量X 是多少？常用的量是多少？

A:(1)X 表示模板 DNA 量需要实验者在首次实验时进行摸索。首先对模板DNA 进行稀释（一般推荐 5–10 倍），然后模板量梯度上样，选择 CT 值落在  20–30  之间的最佳上样量。

(2)常用的量是逆转录 500–1000ng 总RNA，稀释 10 倍取 1μL cDNA 进行qPCR 实验。

Q2:qPCR 实验结果的有效性？为什么建议Ct 值要大于 15？

A🙁1)有效性要满足三个条件：（1）标准曲线：扩增效率范围:90–110%，对应斜率为-3–3.5。R2＞0.98。 (扩增效率=10-1/斜率-1)，当斜率=-3.32 时，扩增效率=100%。
（2）扩增曲线：S 型曲线，且 Ct 值在 15－35 之间，阴性对照 Ct＞35 或无Ct 值。
（3） 熔解曲线：为单一峰。(2)3-15 个循环的荧光值标准差的 10 倍是荧光阈值，Ct 值太小了会影响曲线。

Q3:Rox 的作用？

A:ROX 是一种参比染料，其作用是标准化荧光定量反应中的非PCR 震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。

Q4:为什么扩增曲线不稳定（扩增曲线平台期锯齿状）？
A:可能原因：a）RNA 纯度低，体系中存在较多杂质；推荐参数：OD260/OD280=1.8–2.0， OD260/OD230＞2.0。随着 qPCR 反应的进行，阻碍反应的因素不断增加，若 RNA 纯度低，杂质多，会进一步影响仪器平台期的算法，导致出现锯齿状。

b）仪器长时间未做校准。仪器未校准会使仪器算法错误，导致各种异常结果。

解决方案：a）先梯度加大模板稀释倍数看优化效果。若效果仍不好建议新制备高纯度RNA 重新实验。

b） 定期（一般 1 年）进行仪器校准保养。

Q5:为什么扩增曲线无法达到平台期？

A:可能原因：a）模板量太低（CT 值 35 左右）。推荐 Ct 值：15＜Ct＜30。原因：Ct 值太大（如  Ct＞30），刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。
b）循环次数太少（30 cycles）；循环次数过少（如 35）导致刚进入指数扩增期几个循环就停止了反应，故无法到达平台期。
c） 试剂扩增效率低（CT 小，但无法达到平台期，曲线比较“趴”）。
解决方案：a）提高模板量；参考 Q1 的优化方法。

b）提高循环次数；推荐循环数：一般 40。低丰度基因可设 45。
c）做标准曲线测定扩增效率，若确实偏低，则换试剂。

d）增加 Mg2+浓度（会增加非特异扩增）

Q6:为什么出现双峰，并且较低峰 Tm 在 80℃之前？

A:较低峰 Tm 在 80℃之前可能原因：存在引物二聚体（一般mRNA 反转录后定量，产物在 100-150bp 左右，峰对应 Tm 值为 80-90℃。若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现一个峰， 80℃以后出现一个峰），模板浓度过低或引物浓度过高。

解决方案：a）适当提高退火温度； b）提高模板量，降低引物浓度； c）重新设计引物。

Q7:为什么出现双峰，双峰 Tm 都在 80℃以前？

A:双峰Tm 都在 80℃以前的可能原因：做 MicroRNA 定量时存在引物二聚体。Micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十 bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃ 以前出现双峰。

优化方法：提高退火温度、降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。Q8:为什么出现双峰，并且双峰Tm 都在 80℃以后？

A:可能原因：a）引物特异性过差导致非特异性产物扩增。
b）交叉污染。

c）gDNA 污染，可通过 NRC 进行确认。

解决方案：a）Blast 检查引物特异性，差则重新设计引物。
b）超净台中操作，注意更换 Tip 头，避免交叉污染。

c）通过 NRC 阴性对照进行确认，若有，需重新制备模板。

Q9:为什么是单峰，但 Tm 在 80℃之前？

A:可能原因：扩增产物是完全的引物二聚体，可能是未加模板。

注：若 microRNA，则结果正常（做 microRNA 定量时存在引物二聚体。micro RNA 反转录后定量， 产物在 80-90bp 左右，峰对应 Tm 值为 70-80℃，若有引物二聚体存在，引物二聚体大小只有几十bp，峰对应 Tm 值也在 70-80℃之间。故会在 80℃以前出现双峰）。

解决方案：进行高分辨率琼脂糖电泳，检测有无目的条带，以确定模板是否加入。优化方法：新配制无误的反应体系，重新实验。

Q10:为什么是单峰，但峰不尖锐？

A:可能原因：存在大小相近的非特异性扩增

解决方案：a）温度跨度不高于 7℃，视为可用结果（即 Tm 值跨度＜7℃可认为是同一种产物）；

b）进行高浓度琼脂糖电泳（高分辨率），确认是否为单一条带。

[1] Qin Q, Shou J, Li M, et al. Stk24 protects against obesity-associated metabolic disorders by disrupting the NLRP3 inflammasome. Cell Rep. 2021;35(8):109161. doi:10.1016/j.celrep.2021.109161(IF:9.423)
[2] Wu S, Guo X, Zhou J, et al. High expression of UNC5B enhances tumor proliferation, increases metastasis, and worsens prognosis in breast cancer [published online ahead of print, 2020 Sep 9]. Aging (Albany NY). 2020;12(17):17079-17098. doi:10.18632/aging.103639(IF:5.682)
[3] Chen Y, Huang X, Zhu K, et al. LIMD2 is a Prognostic and Predictive Marker in Patients With Esophageal Cancer Based on a ceRNA Network Analysis. Front Genet. 2021;12:774432. Published 2021 Nov 18. doi:10.3389/fgene.2021.774432(IF:4.599)
[4] Pan J, Ren Q, Yang Z, et al. The effect of melatonin on the mouse ameloblast-lineage cell line ALCs. Sci Rep. 2022;12(1):8225. Published 2022 May 17. doi:10.1038/s41598-022-11912-3(IF:4.380)
[5] Li W, Zhang Z, Zhang L, et al. Antiviral Role of Serine Incorporator 5 (SERINC5) Proteins in Classical Swine Fever Virus Infection. Front Microbiol. 2020;11:580233. Published 2020 Sep 4. doi:10.3389/fmicb.2020.580233(IF:4.236)
[6] Hu F, Li C, Zheng X, et al. Lung adenocarcinoma resistance to therapy with EGFR‑tyrosine kinase inhibitors is related to increased expression of cancer stem cell markers SOX2, OCT4 and NANOG. Oncol Rep. 2020;43(2):727-735. doi:10.3892/or.2019.7454(IF:3.417)
[7] Zhao Y, Castro LFC, Monroig Ó, Cao X, Sun Y, Gao J. A zebrafish pparγ gene deletion reveals a protein kinase network associated with defective lipid metabolism [published online ahead of print, 2022 Mar 15]. Funct Integr Genomics. 2022;10.1007/s10142-022-00839-7. doi:10.1007/s10142-022-00839-7(IF:3.410)
[8] Zhang H, Yang X, Hu F, et al. Expression Level of Wnt5a Was Related to the Therapeutic Effects of First-Generation EGFR-TKIs. Onco Targets Ther. 2020;13:5387-5394. Published 2020 Jun 11. doi:10.2147/OTT.S250024(IF:3.337)
[9] Xie J, Cai Z, Zheng W, Zhang H. Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles in response to gut microbiota depletion in the abdomens of female Bactrocera dorsalis [published online ahead of print, 2022 Jun 25]. Insect Sci. 2022;10.1111/1744-7917.13091. doi:10.1111/1744-7917.13091(IF:3.262)