HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,专一快速的检测HEK293细胞残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平且试剂盒中含有UDG酶,可以消除扩增产物带来的污染。试剂盒本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

41306ES50 

(50T)

41306ES60

 (100T)

41306-A

HEK293 qPCR Mix (UDG plus)

0.75 mL

1.5 mL

41306-B

HEK293 Primer&Probe Mix

250 μL

500 μL

41306C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL

1.8 mL

41306D

HEK293 DNA Control (30 ng/μL)

25 μL

50 μL

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输,-20℃保存,有效期2年。41306-A41306B均需避光保存。

2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Bio-RadCFX96 Optic Module

Thermo ScientificABI 7500ABI Quant Studio 5ABI Step OnePlus

上海宏石医疗科技:SLAN-96S

 

使用方法

一、HEK293 DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液DNA定量参考品进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL

具体操作如下:

1. 试剂盒中的HEK293 DNA ControlDNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec

2. 6净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0Std1Std2Std3Std4Std5

3. 在标记为Std01.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer10 μL HEK293 DNA Control (30 ng/μL),即稀释3ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。

4. Std1Std2Std3Std4Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer,再进行梯度稀释,稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

【注】

1. 每个浓度做3个复孔该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围需要,可适当扩大缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于20℃

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天,长时间不用请放置于20℃

4. 为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀1 min

 

二、样本回收质控ERC的制备

根据需要设ERC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加30 pg HEK293 DNA量的ERC为例),具体操作如下

1. 100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL Std3,混匀标记为ERC

2. 回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备回收ERC纯化液。

 

、阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1. 100 μL样本基质溶液DNA Dilution Buffer加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

 

无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC反应体系20 μL Mix混合液(即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL HEK293 Primer&Probe Mix+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

 

、反应体系

组分

体积(μL

HEK293 qPCR Mix (UDG plus)

15

HEK293 Primer&Probe Mix

5

DNA template

10

总体积

30

【注】

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2× (15+5) μL(含有2孔的损失量)。通常每个样本做3个重复孔。

2. 反应孔数=5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)× 3

NTC (No Template Control)DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)待测样本中加入如30 pg标准品DNA后进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC

3. 加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

下图为参考板位:

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

该示例是对HEK293残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个无模板对照NTC1个阴性质控NCS3个待测样本TS3加样回收ERC。建议每个样本3个重复孔。

 

、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2. 创建1个检测探针,命名为HEK293-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none,参比荧光为ROX参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)

3. Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity一栏分别赋值为30000030000300030030(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL;将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的Task一栏设置为Unknown,并且在相应的Sample Name一栏中分别命名为NCSTSERC之后点击Start Run开始仪器运行

4. 扩增程序设置:设置反应体积30 μL

循环步骤

温度()

时间

循环数

扩增产物消化

37℃

5 min

1

预变性

95℃

10 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60℃

30 sec

 

qPCR 结果分析

1. AnalysisAmplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. AnalysisStandard Curve面板中,可读取标准曲线的、扩增效率(Eff%)斜率(Slope)、截距(Intercept)。正常的标曲R²>0.99扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope-3.6~-3.1

3. AnalysisView well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μLpg/mL

4. 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5. 根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加回收率,加回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {本加标测定值(eg.pg/µL)-测定值(eg.pg/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.pg) x 100%

6. 阴性质控NCSCt值应大于标曲最低浓度Ct均值。

HB221130

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

暂无内容

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

暂无内容

 

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,专一快速的检测HEK293细胞残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平且试剂盒中含有UDG酶,可以消除扩增产物带来的污染。试剂盒本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

41306ES50 

(50T)

41306ES60

 (100T)

41306-A

HEK293 qPCR Mix (UDG plus)

0.75 mL

1.5 mL

41306-B

HEK293 Primer&Probe Mix

250 μL

500 μL

41306C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL

1.8 mL

41306D

HEK293 DNA Control (30 ng/μL)

25 μL

50 μL

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输,-20℃保存,有效期2年。41306-A41306B均需避光保存。

2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

3. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Bio-RadCFX96 Optic Module

Thermo ScientificABI 7500ABI Quant Studio 5ABI Step OnePlus

上海宏石医疗科技:SLAN-96S

 

使用方法

一、HEK293 DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液DNA定量参考品进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL

具体操作如下:

1. 试剂盒中的HEK293 DNA ControlDNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec

2. 6净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0Std1Std2Std3Std4Std5

3. 在标记为Std01.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer10 μL HEK293 DNA Control (30 ng/μL),即稀释3ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。

4. Std1Std2Std3Std4Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer,再进行梯度稀释,稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

【注】

1. 每个浓度做3个复孔该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围需要,可适当扩大缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于20℃

3. 已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2-8℃ 7天,长时间不用请放置于20℃

4. 为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀1 min

 

二、样本回收质控ERC的制备

根据需要设ERC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加30 pg HEK293 DNA量的ERC为例),具体操作如下

1. 100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL Std3,混匀标记为ERC

2. 回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备回收ERC纯化液。

 

、阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1. 100 μL样本基质溶液DNA Dilution Buffer加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

 

无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2. 每管或孔中的NTC反应体系20 μL Mix混合液(即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL HEK293 Primer&Probe Mix+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

 

、反应体系

组分

体积(μL

HEK293 qPCR Mix (UDG plus)

15

HEK293 Primer&Probe Mix

5

DNA template

10

总体积

30

【注】

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2× (15+5) μL(含有2孔的损失量)。通常每个样本做3个重复孔。

2. 反应孔数=5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)× 3

NTC (No Template Control)DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)待测样本中加入如30 pg标准品DNA后进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC

3. 加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

下图为参考板位:

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

该示例是对HEK293残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个无模板对照NTC1个阴性质控NCS3个待测样本TS3加样回收ERC。建议每个样本3个重复孔。

 

、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2. 创建1个检测探针,命名为HEK293-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none,参比荧光为ROX参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)

3. Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity一栏分别赋值为30000030000300030030(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL;将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的Task一栏设置为Unknown,并且在相应的Sample Name一栏中分别命名为NCSTSERC之后点击Start Run开始仪器运行

4. 扩增程序设置:设置反应体积30 μL

循环步骤

温度()

时间

循环数

扩增产物消化

37℃

5 min

1

预变性

95℃

10 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60℃

30 sec

 

qPCR 结果分析

1. AnalysisAmplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. AnalysisStandard Curve面板中,可读取标准曲线的、扩增效率(Eff%)斜率(Slope)、截距(Intercept)。正常的标曲R²>0.99扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope-3.6~-3.1

3. AnalysisView well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μLpg/mL

4. 结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5. 根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加回收率,加回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {本加标测定值(eg.pg/µL)-测定值(eg.pg/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.pg) x 100%

6. 阴性质控NCSCt值应大于标曲最低浓度Ct均值。

HB221130

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

暂无内容

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒(2G)

暂无内容

HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,专一快速的检测HEK293细胞残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平且试剂盒中含有UDG酶,可以消除扩增产物带来的污染。试剂盒本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

41302ES50(50T)

41302ES60(100T)

41302-A

HEK293 qPCR mix (UDG plus)

0.8 mL

1.6 mL

41302-B

HEK293 Primer&probe mix

200 μL

400 μL

41302-C

DNA Dilution Buffer

2×2 mL

4×2 mL

41302-D

HEK293 DNA Control(30 ng/μL)

25 μL

50 μL

【注】本试剂盒不含ROX参比染料,若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料,推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye(Cat#10200ES)

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输,-20℃保存,有效期1年。

2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

Thermo Scientific:ABI 7500;ABI Quant Studio 5;ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、HEK293 DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液DNA定量参考品进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下:

1. 将试剂盒中的DNA定量参考品DNA稀释液置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

2. 取6支净的1.5 mL离心管,分别标记为3 ng/μL,

3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA稀释液10 μL DNA定量参考品30 ng/μL),即稀释3 ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。

4. 在 管中先分别加入90 μL DNA稀释液,再进行梯度稀释,稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

【注】

1. 每个浓度做3个复孔该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围需要,可适当扩大缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于20℃

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天,长时间不用请放置于20℃

4. 为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀1 min。

二、样本回收质控QC的制备

根据需要设QC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例),具体操作如下

  1. 100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL溶液,混匀标记为回收QC。
  2. 回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备(可选)

根据需要QC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的标准品回收为例),具体操作如下:

  1. 100 μL 溶液加入1.5 mL的离心管中标记为标准品回收QC。
  2. 标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备标准品回收QC纯化液。

、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控,具体操作如下:

  1. 100 μL样本基质溶液DNA 稀释液加入1.5 mL净的离心管中,标记为阴性质控NCS
  2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

  1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
  2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液(即16 μL HEK293 qPCR mix + 4μL HEK293 Primer&probe mix + 20 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

、反应体系

组分

体积(μL

HEK293 qPCR mix (UDG plus)

16

HEK293 Primer&probe mix

4

DNA template

20

总体积

40

【注】

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液 =(反应孔数+2)× (16+4) μL(含有2孔的损失量)。通常每个样本做3个重复孔。

2. 加样完成密封好管子后,请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

下图为参考板位:

HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

该示例是对HEK293残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:1个无模板对照NTC、5个浓度梯度的DNA标准曲线、3个样本加标回收QC即加样回收QC)3个待测样本3个标准品回收QC(可选)3个阴性质控NCS1个即可建议每个样本3个重复孔。

、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

  1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
  2. 创建1个检测探针,命名为HEK293-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none
  3. Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity 一栏分别赋值为30000030000300030030(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL;将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NCS孔、待测样本孔、样本加标回收QC孔的Task一栏设置为Unknown,并且在相应的Sample Name一栏中分别命名为NCSTSQC,之后点击Start Run开始仪器运行

    4. 扩增程序设置:设置反应体积40 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

扩增产物消化

37 ℃

5 min

1

预变性

95 ℃

10 min

1

变性

95 ℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60 ℃

60 sec

qPCR 结果分析

1.在AnalysisAmplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold 至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在AnalysisStandard Curve面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)斜率(Slope)、截距(Intercept)。正常的标曲R²>0.99;扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内Slope在3.4左右

3. 在AnalysisView well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收QC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

 

HB221226

 

 

HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

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HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

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HEK293宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,专一快速的检测HEK293细胞残留DNA,其最低检测限可以达到fg水平且试剂盒中含有UDG酶,可以消除扩增产物带来的污染。试剂盒本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

41302ES50(50T)

41302ES60(100T)

41302-A

HEK293 qPCR mix (UDG plus)

0.8 mL

1.6 mL

41302-B

HEK293 Primer&probe mix

200 μL

400 μL

41302-C

DNA Dilution Buffer

2×2 mL

4×2 mL

41302-D

HEK293 DNA Control(30 ng/μL)

25 μL

50 μL

【注】本试剂盒不含ROX参比染料,若您目前使用的Real Time PCR扩增仪需要添加ROX参比染料,推荐您购买本公司的50× ROX Reference Dye(Cat#10200ES)

 

运输和保存方法

1. 所有组分均干冰运输,-20℃保存,有效期1年。

2. 收到货后,请检查共4个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 加样和配液步骤尽量都在冰上操作。

3. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

Thermo Scientific:ABI 7500;ABI Quant Studio 5;ABI Step OnePlus.

 

使用方法

一、HEK293 DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA稀释液DNA定量参考品进行梯度稀释,稀释浓度依次为300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下:

1. 将试剂盒中的DNA定量参考品DNA稀释液置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

2. 取6支净的1.5 mL离心管,分别标记为3 ng/μL,

3. 在标记为3 ng/μL的1.5 mL离心管中加90 μL DNA稀释液10 μL DNA定量参考品30 ng/μL),即稀释3 ng/μL,振荡混匀后短时间快速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃期保存(不超过3个月),使用时避免反复冻融。

4. 在 管中先分别加入90 μL DNA稀释液,再进行梯度稀释,稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

10 μL 3 ng/μL+90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

10 μL +90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

【注】

1. 每个浓度做3个复孔该试剂可测试30 fg/μL-300 pg/μL线性范围需要,可适当扩大缩小线性范围。

2. 为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于20℃

3. 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于2-8 ℃ 7天,长时间不用请放置于20℃

4. 为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀1 min。

二、样本回收质控QC的制备

根据需要设QC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的样本加标回收为例),具体操作如下

  1. 100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,再加入10 μL溶液,混匀标记为回收QC。
  2. 回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备回收QC纯化液。

三、标准品回收质控QC的制备(可选)

根据需要QC中的HEK293 DNA标准品浓度(以制备加3 pg/μL DNA量的标准品回收为例),具体操作如下:

  1. 100 μL 溶液加入1.5 mL的离心管中标记为标准品回收QC。
  2. 标准品回收QC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备标准品回收QC纯化液。

、阴性质控NCS的制备

根据实验设置阴性质控,具体操作如下:

  1. 100 μL样本基质溶液DNA 稀释液加入1.5 mL净的离心管中,标记为阴性质控NCS
  2. 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

  1. 无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。
  2. 每管或孔中的NTC样本为20 μL Mix混合液(即16 μL HEK293 qPCR mix + 4μL HEK293 Primer&probe mix + 20 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

、反应体系

组分

体积(μL

HEK293 qPCR mix (UDG plus)

16

HEK293 Primer&probe mix

4

DNA template

20

总体积

40

【注】

1. 根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液 =(反应孔数+2)× (16+4) μL(含有2孔的损失量)。通常每个样本做3个重复孔。

2. 加样完成密封好管子后,请先低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

下图为参考板位:

HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

该示例是对HEK293残留DNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:1个无模板对照NTC、5个浓度梯度的DNA标准曲线、3个样本加标回收QC即加样回收QC)3个待测样本3个标准品回收QC(可选)3个阴性质控NCS1个即可建议每个样本3个重复孔。

、扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

  1. 创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
  2. 创建1个检测探针,命名为HEK293-DNA,选择报告荧光基团为FAM,猝灭荧光基团为none
  3. Assign target (s) to the selected wells面板中,将标准曲线孔的Task一栏设置为Standard,并且在Quantity 一栏分别赋值为30000030000300030030(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的sample name一栏中命名为300 pg/μL30 pg/μL3 pg/μL300 fg/μL30 fg/μL;将无模板对照NTC孔的Task一栏设置为NTC;将阴性质控NCS孔、待测样本孔、样本加标回收QC孔的Task一栏设置为Unknown,并且在相应的Sample Name一栏中分别命名为NCSTSQC,之后点击Start Run开始仪器运行

    4. 扩增程序设置:设置反应体积40 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

扩增产物消化

37 ℃

5 min

1

预变性

95 ℃

10 min

1

变性

95 ℃

15 sec

40

退火/延伸(收集荧光)

60 ℃

60 sec

qPCR 结果分析

1.在AnalysisAmplification Plot面板中,系统会自动给出Threshold,有时系统给出的Threshold离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节Threshold 至合适位置,点击Analyze。此时可在Multicomponent Plot初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2. 在AnalysisStandard Curve面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)斜率(Slope)、截距(Intercept)。正常的标曲R²>0.99;扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内Slope在3.4左右

3. 在AnalysisView well table面板中,Quantity一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收QC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

 

HB221226

 

 

HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

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HEK293细胞残留DNA检测试剂盒|HEK293 Host Cell DNA Residue Detection Kit

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TGR HEK 293细胞

 

TGR BioSciences Pty Ltd(TGR)是一家位于澳大利亚阿德莱德的私营公司。TGR成立于2001年,致力于为基于细胞的研究应用提供创新解决方案。我们的科学家拥有细胞生物学,生物化学和免疫测定设计方面的专业知识,并开发出高质量的产品和服务,这些产品和服务已成功应用于世界各地的药物发现计划。

 

我们的旗舰免疫检测系列SureFire®是一系列用于分析细胞磷蛋白的检测试剂盒,由我们位于阿德莱德的工厂生产。SureFire和SureFire Ultra试剂盒通过PerkinElmer,Inc。(美国)分销,PerkinElmer,Inc。是实验室试剂的市场领者。SureFire和SureFire Ultra检测器目前提供100多种SureFire试剂盒,可提供的工具箱,用于以均质形式测量内源性信号蛋白。

TGR的ELISAONE™是一种高灵敏度的免疫分析技术,无需标准ELISA应用所需的所有处理步骤即可提供快速结果。ELISAONE还为该平台带来了灵活性,允许用户使用标准读板器在单个96孔板上测量多个靶标。ELISAONE代表ELISA技术的下一代产品,现已通过我们的分销合作伙伴在美国和加拿大销售。

 

HEK 293细胞

、HEK 293细胞是衍生自人胚肾制剂的转化细胞系。因为它们是通过实验转化的,所以HEK 293细胞对于正常肾细胞来说不是特别好的模型,但是它们易于培养和转染,并且通常用作检查转染受体的模型。它们具有几种可以被利用的完整信号传导途径,特别是ERK,p38 MAPK和JNK途径,其可以用于监测特定转染的受体介导的信号传导事件。这些细胞不太适用于检测PI3-激酶介导的信号传导,因为它们通常显示组成型活性Akt。

 

警告:  这些细胞含有腺病毒,应小心处理。

细胞模型

 

TGR在许多细胞模型中与细胞信号传导途径一起工作,包括癌症模型和原代细胞培养物。

细胞模型包括:

  • A431
  • C2C12
  • CHO
  • HEK 293
  • Hela
  • Jurkat
  • MCF7
  • TF-1
  • THP-1
  • U-2 OS

 

 

A431细胞

 

A431细胞来自85岁的女性表皮。表皮样癌细胞系表达非常高水平的表皮生长因子(EGF)受体,并且表现出MAPK途径的高基础活化。因此,即使血清饥饿,对于诸如MEK和ERK的靶标,MAPK途径组分的进一步活化超过基础活化水平也是困难的。然而,使用EGF受体抑制剂如AG1478可以显着降低MAPK信号传导途径的活化。通过EGF受体的STAT信号传导也可以在A431细胞中诱导,并且STAT1,STAT3和STAT5磷酸化都是容易检测的。

 

 

C2C12细胞

 

C2C12细胞是小鼠成肌细胞系,初是通过在挤压伤后从C3H小鼠的大腿肌肉中培养的成肌细胞的连续传代获得的。C2C12细胞能够分化,可用于研究成肌细胞和成骨细胞的分化。这些细胞表达对TGFβ超家族有反应的受体,可用于检测TGFβ和BMP介导的Smad信号传导。

CHO细胞

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是源自中国仓鼠卵巢的细胞系。它们通常用于生物学和医学研究中作为转染受体和其他蛋白质的细胞背景,并且在商业上用于治疗性蛋白质的生产。它是一种贴壁细胞系,生长迅速,易于培养和处理。携带转染的G蛋白偶联受体(GPCR)的CHO细胞已广泛用于许多功能读数,包括常见的GPCR第二信使,例如环AMP,钙动员和ERK磷酸化。

HEK 293细胞

HEK 293细胞是衍生自人胚肾制剂的转化细胞系。因为它们是通过实验转化的,所以HEK 293细胞对于正常肾细胞来说不是特别好的模型,但是它们易于培养和转染,并且通常用作检查转染受体的模型。它们具有几种可以被利用的完整信号传导途径,特别是ERK,p38 MAPK和JNK途径,其可以用于监测特定转染的受体介导的信号传导事件。这些细胞不太适用于检测PI3-激酶介导的信号传导,因为它们通常显示组成型活性Akt。

警告:  这些细胞含有腺病毒,应小心处理。

Hela细胞

Hela细胞来源于宫颈腺癌,是研究中古老和广泛使用的细胞系之一。细胞很容易繁殖,并迅速生长。它们表达几种主要的细胞信号传导途径,并且MAPK,p38,JNK,Akt信号传导都可以容易地检测到。还可以检测ATM / ATR信号传导途径成分,例如Chk1,Chk2和p53。

警告: 这些细胞含有乳多空病毒,应小心处理。

Jurkat细胞

Jurkats是产生IL-2的T淋巴细胞系,通常用于研究T细胞信号传导。Jurkat细胞由患有T细胞白血病的14岁男孩的外周血建立,也可用于研究急性T细胞白血病。Jurkat细胞易于培养,并迅速生长。它们表达易于检测的STAT1,STAT3和STAT5水平,因此可用于分析细胞因子信号传导。Jurkat细胞也可用于观察应激介导的途径,包括p38 MAPK,JNK信号传导和NF-κB信号传导。

MCF7细胞

MCF-7是广泛使用的上皮癌细胞系,源自乳腺癌。MCF7细胞保留分化的乳腺上皮的特征,包括通过细胞质雌激素受体处理雌二醇的能力。虽然易于繁殖,但细胞通常生长缓慢。MCF7细胞可用于检测MAPK和PI3K组分,并且在这些细胞中可容易地检测到ERK和Akt磷酸化。MCF7细胞表达特别高水平的p70S6K,因此可以是上游激酶如mTOR和PDK-1的有用标记物。

TF-1细胞

TF-1细胞系由来自患有严重全血细胞减少症的35岁男性的肝素化骨髓抽吸样品建立。细胞*依赖于IL-3或GM-CSF进行培养,但在这些因子存在下迅速生长。TF-1细胞对多种细胞因子起反应,并且是研究细胞因子信号传导机制的有用工具,因为它们携带多种内源性受体。内源性STAT1,STAT3和STAT5的磷酸化在这些细胞中是容易检测的,并且为细胞因子应答提供了方便的标记。

THP-1细胞

THP-1细胞是从患有急性单核细胞白血病的患者的外周血分离的单核细胞。THP-1细胞具有Fc和C3b受体,缺乏表面和细胞质免疫球蛋白。在这些细胞中也检测到IL-6和GM-CSF受体。作为细胞信号传导的模型,THP-1细胞可用于检测ERK,p38 MAPK和JNK信号传导,以及细胞因子受体介导的STAT信号传导。THP-1细胞可从ATCC获得(目录号#TIB-202)。

U-2 OS细胞

U-2 OS是人骨肉瘤细胞系。U-2 OS细胞系由患有骨肉瘤的十五岁人类女性的骨组织建立。成立于1964年,原始细胞取自中度分化的胫骨肉瘤。U-2 OS细胞具有粘附性且易于生长。这些细胞表达易于检测的p53水平,并且可以容易地用DNA损伤性化学物质如阿霉素或依托泊苷上调。

 

 

 

上海金畔生物科技有限公司是实验试剂一站式采购服务商

1:强大的进口辐射能力,血清、抗体、耗材、大部分限制进口品等。

2:产品种类齐全,经营超过700多品牌,基本涵盖所有生物实验试剂耗材。

3:提供加急服务,货品一般1-2周到货。

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5:多年积累良好的信誉,大部分客户提供货到付款服务。客户包括清华、北大、交大、复旦、中山等100多所高校,ROCHE,阿斯利康、国药、fisher等知药企。

6:我们还是Santa,Advanced Biotechnologies Inc,Athens Research & Technology,bangs,BBInternational,crystalchem,dianova,FD Neurotechnologies,Inc. FormuMax Scientific,Inc, Genebridege, Glycotope Biotechnology GmbH; iduron,Innovative Research of America, Ludger, neuroprobe,omicronbio, Polysciences,prospecbi, QA-BIO,quickzyme,RESEARCH DIETS,INC,sterlitech;sysy,TriLink BioTechnologies,Inc;worthington-biochem,zyagen等几十家国外公司代理。

7:我们还是invitrogen,qiagen,MiraiBioam,sigma;neb,roche,merck, rnd,BD, GE,pierce,BioLegend等知*批发,欢迎合作。

 

 

HEK293宿主细胞残留DNA片段定量分析试剂盒

HEK293宿主细胞残留DNA片段定量分析试剂盒

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

HEK293宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中不同长度的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,专一快速检测200 bp以下及以上的HEK293 DNA残留,其定量限可以达到10 fg/μL水平且配套有HEK293 DNA Control(DNA定量参考品)。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

组分信息

组分编号

组分名称

41316ES70

41316ES74

41316-A

HEK293 qPCR Mix

0.75 mL×4

1.5 mL×4管

41316-B1

HEK293 Primer&Probe Mix-82

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B2

HEK293 Primer&Probe Mix-133

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B3

HEK293 Primer&Probe Mix-227

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B4

HEK293 Primer&Probe Mix-515

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4管

41316-D

HEK293 DNA Control(30 ng/μL)

25 μL×1管

50 μL×1管

 

储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年其中A组分B1、B2、B3、B4组分需避光保存。

2. 收到货后,请检查共7个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. HEK293 DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

HEK293片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段分别为:82 bp、133 bp、227 bp、515 bp。在建立标曲时,需分别对不同的扩增片段设置标曲,并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将HEK293 DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下:

1将试剂盒中HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

26支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0Std1Std2Std3Std4Std5。

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL HEK293 DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std0Std1Std2Std3Std4Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试300 pg/μL-30 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-20℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 待测样本TS的制备

根据实验设置待测样本TS,具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,标记为TS,进行样本前处理,制备待测样本TS纯化液。

2)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的待测样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

3)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的NCS样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2每管或孔中NTC样本20 μL Mix混合液(即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL对应HEK293 Primer&Probe Mix+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

5. 反应体系

82 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-82

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

2 82 bp扩增片段的反应体系

133 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-133

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

3 133 bp扩增片段的反应体系

227 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-227

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

4 227 bp扩增片段的反应体系

515 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-515

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

5 515 bp扩增片段的反应体系

*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+5) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS)× 3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

82 bp

133 bp

227 bp

515 bp

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

B

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

C

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

D

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

E

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

F

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

G

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

H

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

6 上机参考板位

该示例是对HEK293残留DNA各扩增片段分析的qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个待测样本TS、1个阴性质控NCS、1个无模板对照NTC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2针对四种不同长度扩增片段创建新检测探针分别命名为HEK293-82HEK293-133HEK293-227HEK293-515”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“none”检测参比荧光为ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”“30000”“3000”“300”“30”(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”“30 pg/μL”“3 pg/μL”“300 fg/μL”“30 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

污染消化

37℃

5 min

1

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

45

退火

60℃

30 sec

延伸(收集荧光)

72℃

30 sec

7 扩增程序

7. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS,单位为fg/μL,后续可在检测报告中进行单位换算。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

6无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。

 

Ver.CN20230515

HEK293宿主细胞残留DNA片段定量分析试剂盒

暂无内容

HEK293宿主细胞残留DNA片段定量分析试剂盒

暂无内容

 

HEK293宿主细胞残留DNA片段分析试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中不同长度的HEK293残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用qPCR荧光探针原理,专一快速检测200 bp以下及以上的HEK293 DNA残留,其定量限可以达到10 fg/μL水平且配套有HEK293 DNA Control(DNA定量参考品)。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

组分信息

组分编号

组分名称

41316ES70

41316ES74

41316-A

HEK293 qPCR Mix

0.75 mL×4

1.5 mL×4管

41316-B1

HEK293 Primer&Probe Mix-82

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B2

HEK293 Primer&Probe Mix-133

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B3

HEK293 Primer&Probe Mix-227

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-B4

HEK293 Primer&Probe Mix-515

250 μL×1管

500 μL×1管

41316-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4管

41316-D

HEK293 DNA Control(30 ng/μL)

25 μL×1管

50 μL×1管

 

储存条件

1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年其中A组分B1、B2、B3、B4组分需避光保存。

2. 收到货后,请检查共7个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

1. 本产品仅作科研用途

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。

 

适用机型

包含但不限于以下仪器:

Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5,ABI Step OnePlus;

Bio-Rad:CFX96 Optic Module;

上海宏石医疗科技:SLAN-96S。

 

使用说明

1. HEK293 DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

HEK293片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段分别为:82 bp、133 bp、227 bp、515 bp。在建立标曲时,需分别对不同的扩增片段设置标曲,并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer(DNA稀释液)将HEK293 DNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下:

1将试剂盒中HEK293 DNA Control和DNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。

26支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0Std1Std2Std3Std4Std5。

3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL HEK293 DNA Control,即稀释为3 ng/μL,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于20℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。

4)在Std0Std1Std2Std3Std4Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****具体稀释方法如下:

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试300 pg/μL-30 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-20℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-20℃。

****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 待测样本TS的制备

根据实验设置待测样本TS,具体操作如下:

1100 μL待测样本加入1.5 mL净的离心管中,标记为TS,进行样本前处理,制备待测样本TS纯化液。

2)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的待测样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:

1100 μL样本基质溶液(或DNA稀释液)加入1.5 mL净的离心管中,标记为NCS

2阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。

3)为了满足同步进行四个不同扩增长度的片段分析检测需求,前处理后的NCS样品量需≥120 μL,因此建议每个样品同时准备2管进行前处理,提取完成后混匀使用。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:

1无模板对照NTC无需进行样本前处理,qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2每管或孔中NTC样本20 μL Mix混合液(即15 μL HEK293 qPCR Mix + 5μL对应HEK293 Primer&Probe Mix+ 10 μL DNA Dilution Buffer建议配置3个重复孔的量

5. 反应体系

82 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-82

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

2 82 bp扩增片段的反应体系

133 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-133

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

3 133 bp扩增片段的反应体系

227 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-227

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

4 227 bp扩增片段的反应体系

515 bp反应体系

体积(μL)

HEK293 qPCR Mix*

15

HEK293 Primer&Probe Mix-515

5

DNA Template**

10

总体积***

30

 

5 515 bp扩增片段的反应体系

*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+5) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=(5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+N个待测样TS)× 3。

NTC (No Template Control):DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS

TS (Test Sample):待测样本

***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。

为参考板位:

 

82 bp

133 bp

227 bp

515 bp

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

Std1

B

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

Std2

C

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

Std3

D

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

Std4

E

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

Std5

F

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

TS

G

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

NCS

H

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

NTC

6 上机参考板位

该示例是对HEK293残留DNA各扩增片段分析的qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:5个浓度梯度的HEK293 DNA标准曲线、1个待测样本TS、1个阴性质控NCS、1个无模板对照NTC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)

1创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。

2针对四种不同长度扩增片段创建新检测探针分别命名为HEK293-82HEK293-133HEK293-227HEK293-515”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“none”检测参比荧光为ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。

3“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”“30000”“3000”“300”“30”(含义为每孔的DNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏中命名为“300 pg/μL”“30 pg/μL”“3 pg/μL”“300 fg/μL”“30 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。

4扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。

循环步骤

温度(℃)

时间

循环数

污染消化

37℃

5 min

1

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

45

退火

60℃

30 sec

延伸(收集荧光)

72℃

30 sec

7 扩增程序

7. qPCR结果分析

1“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。

3“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS,单位为fg/μL,后续可在检测报告中进行单位换算。

4结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。

5阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

6无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。

 

Ver.CN20230515

HEK293宿主细胞残留DNA片段定量分析试剂盒

暂无内容

HEK293宿主细胞残留DNA片段定量分析试剂盒

暂无内容

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

来源于人胚胎肾细胞的HEK293细胞由于其易于转染的特点,目前被广泛用于各种治疗性蛋白、疫苗中的病毒样颗粒(VLP)、细胞和基因治疗中的病毒载体生产或开展相关科学研究。在这些产品的生产纯化过程中不可避免的会引入宿主细胞蛋白(HCP)杂质,从而降低产品的疗效,并导致不良的毒性或免疫反应,因此需要将 HCP杂质降至最低实用水平。

ELISA法是一种使用简单、灵敏度高且客观的HCP检测方法。本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫检测(ELISA)的实验原理进行HEK293 HCP残留量检测,将HEK293 HCP标准品(36713-B)和待测样本加入预包被抗HEK293 HCP抗体的酶标板(36713-A),然后加入稀释后的生物素标记的HEK293 HCP检测抗体(36713-C),最后加入Streptavidin-HRP(SA-HRP)(36713-D),形成抗体+抗原+抗体‐Biotin+ SA‐HRP 复合物,洗板后加入TMB显色液(36713-H)显色。TMB在HRP酶的催化下由无色转化成蓝色并在终止液(36713-I)的作用下最终转化成黄色。黄色的深浅与样本中被检测到的HEK293 HCP的量呈正相关。本试剂盒可以用于生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

 

产品信息

货号

36713ES48 / 36713ES96

规格

48 T / 96 T

检测范围

3.125-200 ng/mL

检测方法

双抗夹心法

检测时长

4小时

灵敏度

1.5 ng/mL

回收率

75 – 125%

板内差

<10%

板间差

<15%

 

实验数据

  1. 标曲数据

典型的参考标准曲线如下(以下标准曲线图仅供参考,应以同次实验标准品所绘标准曲线计算样本含量):

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

  1. 检测流程图

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

2:实验步骤流程简图

 

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

暂无内容

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

暂无内容

 

来源于人胚胎肾细胞的HEK293细胞由于其易于转染的特点,目前被广泛用于各种治疗性蛋白、疫苗中的病毒样颗粒(VLP)、细胞和基因治疗中的病毒载体生产或开展相关科学研究。在这些产品的生产纯化过程中不可避免的会引入宿主细胞蛋白(HCP)杂质,从而降低产品的疗效,并导致不良的毒性或免疫反应,因此需要将 HCP杂质降至最低实用水平。

ELISA法是一种使用简单、灵敏度高且客观的HCP检测方法。本试剂盒应用双抗夹心酶联免疫检测(ELISA)的实验原理进行HEK293 HCP残留量检测,将HEK293 HCP标准品(36713-B)和待测样本加入预包被抗HEK293 HCP抗体的酶标板(36713-A),然后加入稀释后的生物素标记的HEK293 HCP检测抗体(36713-C),最后加入Streptavidin-HRP(SA-HRP)(36713-D),形成抗体+抗原+抗体‐Biotin+ SA‐HRP 复合物,洗板后加入TMB显色液(36713-H)显色。TMB在HRP酶的催化下由无色转化成蓝色并在终止液(36713-I)的作用下最终转化成黄色。黄色的深浅与样本中被检测到的HEK293 HCP的量呈正相关。本试剂盒可以用于生物制品纯化工艺过程的优化、中间工艺过程的杂质控制以及终产品的放行检测。

 

产品信息

货号

36713ES48 / 36713ES96

规格

48 T / 96 T

检测范围

3.125-200 ng/mL

检测方法

双抗夹心法

检测时长

4小时

灵敏度

1.5 ng/mL

回收率

75 – 125%

板内差

<10%

板间差

<15%

 

实验数据

  1. 标曲数据

典型的参考标准曲线如下(以下标准曲线图仅供参考,应以同次实验标准品所绘标准曲线计算样本含量):

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

  1. 检测流程图

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

2:实验步骤流程简图

 

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

暂无内容

HEK293宿主细胞蛋白(HCP)残留量ELISA检测试剂盒(HEK293 HCP ELISA kit)

暂无内容