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GMyc-PCR支原体检测试剂盒 PCR法支原体检测试剂盒|GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit

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GMyc-PCR支原体检测试剂盒 PCR法支原体检测试剂盒|GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述

细胞培养是生命科学研究中常见的实验。不像其它常用的实验方法，细胞培养是一个动态的连续过程，细胞通常会对操作失误或污染物有所反应，这些反应往往表现出不正常的细胞状态或培养基外观。如果受到支原体污染时，细胞形态较之无明显变化，极易被忽视，往往直到污染非常严重时才能发现。受污染的细胞膜上可能有几百个支原体，这些支原体竞争营养并释放有毒的代谢产物，严重影响实验结果。

研究表明，至少二十多种支原体能污染细胞，其中最常见的有：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、发酵支原体（M. fermentans）、人型支原体（M. hominis）、唾液支原体（M.salivarium）、肺支原体（M.pulmonis）和梨支原体（M.pirum）等。培养细胞的支原体污染率在4%-92%不等，其污染来源包括工作环境、操作者本身（一些支原体是人体的正常菌群）、培养基、血清、细胞交叉污染、实验器材和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

确认细胞培养过程中出现问题的潜在原因是一项困难且耗时的任务，在细胞培养中，任何突然的变化都应该被怀疑，同时良好的试验规范和定期检测支原体污染也十分必要。支原体检测的方法有很多种，如直接培养、DNA荧光染色、ELISA和PCR法等。

GMyc-PCR支原体检测试剂盒主要采用PCR方法对各种生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等）支原体感染的检测。它综合了几个优势：灵敏、特异、快速并且可以用直接用细胞培养上清液检测。本制品通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体，所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计，只特异性扩增支原体DNA，检出灵敏度与特异性均较高。PCR扩增及电泳分析只需数个小时，操作方便简单。

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

40601ES10

40601ES20

40601-A

GMyc-1st PCR Mix

250 µL

2×250 µL

40601-B

GMyc-2nd PCR Mix

250 µL

2×250 µL

40601-C

Positive Control Template

20 µL

20 µL

【注】：

  1. 40601-C长期不用时，可-85~-65℃冷冻保存。
  2. PCR反应极其灵敏，为防止假阳性，加样时，最后加阳性对照。

 

运输与保存方法

干冰运输，-25~-15℃保存，有效期18个月。若较长时间不用，请避光保存。

 

实验流程

此PCR反应为巢式PCR，第一轮PCR结束后，取其反应产物为第二轮PCR模板。根据两轮PCR产物电泳条带之有无及片段大小来分析结果（第一轮阳性对照PCR条带大小为448bp、第二轮阳性对照PCR条带大小为304bp）。细胞培养3-6天后，直接取其上清液进行PCR反应。为排除细胞培养基抑制PCR反应，阳性对照中需加入等量的细胞上清液。

第一轮PCR：

1. 充分融解GMyc-1st PCR Mix（40601-A），按下列表格配制反应液：

试剂

实验组

阳性对照

阴性对照

GMyc-1st PCR Mix（40601-A）

25 µL

25 µL

25 µL

样品

4 µL

4 µL

/

ddH2O

21 µL

20 µL

25 µL

Positive Control Template（40601-C）

/

1 µL

/

【注】：为防止Positive Control Template（40601-C）污染，请将实验组和阴性对照组加完以后，最后再将Positive Control Template（40601-C）加入阳性对照组。

2. 按下列条件进行PCR反应：

94 ℃         5 min

GMyc-PCR支原体检测试剂盒 PCR法支原体检测试剂盒|GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit94 ℃         30 s

58 ℃         30 s      30~35 cycles

72 ℃         30 s

72 ℃         7 min

第二轮PCR：

1. 充分融解PCR Mix，按下列表格配制反应液：

试剂

实验组

阳性对照

阴性对照

GMyc-2nd PCR Mix

25 µL

25 µL

25 µL

ddH2O

24 µL

24 µL

24 µL

1st PCR反应液（1000倍稀释液）

1 µL

1 µL

1 µL

【注】: 第一轮PCR反应液需经1000倍稀释后方可用于第二轮PCR模板。

2. 按下列条件进行PCR反应：

94 ℃         5 min

GMyc-PCR支原体检测试剂盒 PCR法支原体检测试剂盒|GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit94 ℃         30 s

58 ℃         30 s     30~35 cycles

72 ℃         30 s

72 ℃         7 min

反应结束后，取7 μL 的PCR反应液（不需要加loading buffer）直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。

【注】: 跑胶时不需要额外添加loading buffer，但需要额外加入染料，避免出现没有条带的情况。

 

推荐使用频率

新细胞进入实验室

必检

液氮保存前

必检

定期常规

每月检测一次

发现污染后

每周检测一次

发现细胞异常

随时检测

 

注意事项

1）使用本试剂前请仔细阅读本说明书全文。

2）操作时应尽量少说话，因口腔中也含有支原体，可能引起样品污染，而造成假阳性；整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行，以避免交叉污染。

3）实验时，试剂盒组分中的试剂使用前应充分融化并混匀（混匀时禁止激烈振荡，只需要进行上下倒置多次进行混匀）。

4）反应管中加好所有的试剂后，应尽快上PCR仪进行扩增，以免形成过多的二聚体。

5）细胞培养物中含有青霉素和链霉素等抗生素不会影响本品的检测结果。如果用户需要进一步提高检测灵敏度，建议细胞在不含青霉素和链霉素等抗生素中进行培养2-3天后送样检测。

6）为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

7）本产品仅作科研用途！

 

HB230301

Q：检测准吗？巢式 pcr 什么意思？为什么要做两轮 pcr？

A：巢式 PCR 通过两轮扩增的方式，增加了产品的特异性和灵敏度，可以对 10 拷贝的支原体进行检测。

Q：GMyc-PCR 支原体检测试剂盒，能测细胞吗？细胞支原体测定方法是什么样的？

A：可以的，如果使用细胞悬液做样品，则需要提取DNA 后再进行 PCR。加入量一般为反应体系 1/10 的量或更少。

Q：对于同一个样品，为什么一步法恒温试剂盒检测结果为阳性，而 PCR 检测为阴性呢？

A：一步法恒温检测试剂盒检测的支原体的种类是 27 种，而 PCR 检测方法检测的是常见的 13 种支原体。样品中污染的支原体可能不包括在 PCR 法检测的支原体种类内。

Q：巢式 PCR 法和一步法恒温支原体检测试剂盒他们的优势在哪些方面，怎么选择？

A：PCR 法的灵敏度高于一步法检测，而一步法的灵敏度是 10^3 个拷贝才能检测出来。一步法检测的细胞支原体种类达 20 多种多于 PCR 法。

Q：GMyc-PCR 支原体检测结果如何判断？

A：GMyc-PCR 支原体检测方法通过巢式 PCR 的方式获得检测结果。整个实验由 2 轮PCR 组成，检测结果以第二轮为准。

Q：说明书中写的是不加loading buffer，直接点样就可以，我点样之后所哟有样品均没有条带（包含阳性对照），阳性对照加了loading buffeer才有条带。

A： 经确定客户配胶的时候未加入EB染料，他们的染料是加在loading buffer中的，所以不加入自己的loading buffer跑不出条带。

EB加入方式：

      1.如果配琼脂糖凝胶的时候加入EB染料，跑胶的的样品中不需要加入了

      2.如果配琼脂糖凝胶的时候未加入EB染料，跑胶的的样品中需要加入EB染料

Q：阳性对照是哪种支原体呢？

A：猪鼻子支原体

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[2] Guo F, Li L, Li J, et al. Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells. Cell Res. 2017;27(8):967-988. doi:10.1038/cr.2017.82(IF:15.606)
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[5] Li X, Xiong X, Wang K, et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N(1)-methyladenosine methylome. Nat Chem Biol. 2016;12(5):311-316. doi:10.1038/nchembio.2040(IF:12.709)
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[30] Xu Y, Wang X, Qiu T, et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line (FDCHI007-A) derived from a patient with developmental and epileptic encephalopathy Type 31 carrying heterozygous c.545C > A mutation in DNM1 gene. Stem Cell Res. 2022;60:102709. doi:10.1016/j.scr.2022.102709(IF:2.020)
[31] Fan T, He J, Wang Y, Yu J, Sun W. Generation of an induced pluripotent stem cell line (FDCHi006-A) from a 7-year-old girl with central precocious puberty. Stem Cell Res. 2021;56:102542. doi:10.1016/j.scr.2021.102542(IF:2.020)
[32] Gong X, Zheng Z, Yang T, Zheng H, Xiao X, Jia N. Generation of an isogenic gene-corrected iPSC line (OGHFUi001-A-1) from a type 1 early infantile epileptic encephalopathy (EIEE1) patient with a hemizygous R330L mutation in the ARX gene. Stem Cell Res. 2022;60:102693. doi:10.1016/j.scr.2022.102693(IF:2.020)
[33] Jia N, Gong X, Chen J, et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line (OGHFUi001-A) from a type 1 early infantile epileptic encephalopathy with ARX mutation. Stem Cell Res. 2021;53:102367. doi:10.1016/j.scr.2021.102367(IF:2.020)
[34] Zhu W, Zhou Y, Wang Q, et al. Generation of a human induced pluripotent stem cell (iPSC) line from skin fibroblasts of a patient carrying an E363Q mutation in PSEN1 gene. Stem Cell Res. 2022;61:102769. doi:10.1016/j.scr.2022.102769(IF:2.020)
[35] Luo F, Long K, Li X, et al. Deficient of LRRC8A attenuates hypoxia-induced necrosis in 3T3-L1 cells. Biosci Biotechnol Biochem. 2020;84(6):1139-1145. doi:10.1080/09168451.2020.1730689(IF:1.516)

产品描述

细胞培养是生命科学研究中常见的实验。不像其它常用的实验方法，细胞培养是一个动态的连续过程，细胞通常会对操作失误或污染物有所反应，这些反应往往表现出不正常的细胞状态或培养基外观。如果受到支原体污染时，细胞形态较之无明显变化，极易被忽视，往往直到污染非常严重时才能发现。受污染的细胞膜上可能有几百个支原体，这些支原体竞争营养并释放有毒的代谢产物，严重影响实验结果。

研究表明，至少二十多种支原体能污染细胞，其中最常见的有：口腔支原体（M.orale）、精氨酸支原体（M.arginini）、猪鼻支原体（M.hyorhinis）、发酵支原体（M. fermentans）、人型支原体（M. hominis）、唾液支原体（M.salivarium）、肺支原体（M.pulmonis）和梨支原体（M.pirum）等。培养细胞的支原体污染率在4%-92%不等，其污染来源包括工作环境、操作者本身（一些支原体是人体的正常菌群）、培养基、血清、细胞交叉污染、实验器材和用来制备细胞的原始组织或器官的污染。

确认细胞培养过程中出现问题的潜在原因是一项困难且耗时的任务，在细胞培养中，任何突然的变化都应该被怀疑，同时良好的试验规范和定期检测支原体污染也十分必要。支原体检测的方法有很多种，如直接培养、DNA荧光染色、ELISA和PCR法等。

GMyc-PCR支原体检测试剂盒主要采用PCR方法对各种生物材料（如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等）支原体感染的检测。它综合了几个优势：灵敏、特异、快速并且可以用直接用细胞培养上清液检测。本制品通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体，所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计，只特异性扩增支原体DNA，检出灵敏度与特异性均较高。PCR扩增及电泳分析只需数个小时，操作方便简单。

 

产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

40601ES10

40601ES20

40601-A

GMyc-1st PCR Mix

250 µL

2×250 µL

40601-B

GMyc-2nd PCR Mix

250 µL

2×250 µL

40601-C

Positive Control Template

20 µL

20 µL

【注】：

  1. 40601-C长期不用时，可-85~-65℃冷冻保存。
  2. PCR反应极其灵敏，为防止假阳性，加样时，最后加阳性对照。

 

运输与保存方法

干冰运输，-25~-15℃保存，有效期18个月。若较长时间不用，请避光保存。

 

实验流程

此PCR反应为巢式PCR，第一轮PCR结束后，取其反应产物为第二轮PCR模板。根据两轮PCR产物电泳条带之有无及片段大小来分析结果（第一轮阳性对照PCR条带大小为448bp、第二轮阳性对照PCR条带大小为304bp）。细胞培养3-6天后，直接取其上清液进行PCR反应。为排除细胞培养基抑制PCR反应，阳性对照中需加入等量的细胞上清液。

第一轮PCR：

1. 充分融解GMyc-1st PCR Mix（40601-A），按下列表格配制反应液：

试剂

实验组

阳性对照

阴性对照

GMyc-1st PCR Mix（40601-A）

25 µL

25 µL

25 µL

样品

4 µL

4 µL

/

ddH2O

21 µL

20 µL

25 µL

Positive Control Template（40601-C）

/

1 µL

/

【注】：为防止Positive Control Template（40601-C）污染，请将实验组和阴性对照组加完以后，最后再将Positive Control Template（40601-C）加入阳性对照组。

2. 按下列条件进行PCR反应：

94 ℃         5 min

GMyc-PCR支原体检测试剂盒 PCR法支原体检测试剂盒|GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit94 ℃         30 s

58 ℃         30 s      30~35 cycles

72 ℃         30 s

72 ℃         7 min

第二轮PCR：

1. 充分融解PCR Mix，按下列表格配制反应液：

试剂

实验组

阳性对照

阴性对照

GMyc-2nd PCR Mix

25 µL

25 µL

25 µL

ddH2O

24 µL

24 µL

24 µL

1st PCR反应液（1000倍稀释液）

1 µL

1 µL

1 µL

【注】: 第一轮PCR反应液需经1000倍稀释后方可用于第二轮PCR模板。

2. 按下列条件进行PCR反应：

94 ℃         5 min

GMyc-PCR支原体检测试剂盒 PCR法支原体检测试剂盒|GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit94 ℃         30 s

58 ℃         30 s     30~35 cycles

72 ℃         30 s

72 ℃         7 min

反应结束后，取7 μL 的PCR反应液（不需要加loading buffer）直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。

【注】: 跑胶时不需要额外添加loading buffer，但需要额外加入染料，避免出现没有条带的情况。

 

推荐使用频率

新细胞进入实验室

必检

液氮保存前

必检

定期常规

每月检测一次

发现污染后

每周检测一次

发现细胞异常

随时检测

 

注意事项

1）使用本试剂前请仔细阅读本说明书全文。

2）操作时应尽量少说话，因口腔中也含有支原体，可能引起样品污染，而造成假阳性；整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行，以避免交叉污染。

3）实验时，试剂盒组分中的试剂使用前应充分融化并混匀（混匀时禁止激烈振荡，只需要进行上下倒置多次进行混匀）。

4）反应管中加好所有的试剂后，应尽快上PCR仪进行扩增，以免形成过多的二聚体。

5）细胞培养物中含有青霉素和链霉素等抗生素不会影响本品的检测结果。如果用户需要进一步提高检测灵敏度，建议细胞在不含青霉素和链霉素等抗生素中进行培养2-3天后送样检测。

6）为了您的健康，实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

7）本产品仅作科研用途！

 

HB230301

Q：检测准吗？巢式 pcr 什么意思？为什么要做两轮 pcr？

A：巢式 PCR 通过两轮扩增的方式，增加了产品的特异性和灵敏度，可以对 10 拷贝的支原体进行检测。

Q：GMyc-PCR 支原体检测试剂盒，能测细胞吗？细胞支原体测定方法是什么样的？

A：可以的，如果使用细胞悬液做样品，则需要提取DNA 后再进行 PCR。加入量一般为反应体系 1/10 的量或更少。

Q：对于同一个样品，为什么一步法恒温试剂盒检测结果为阳性，而 PCR 检测为阴性呢？

A：一步法恒温检测试剂盒检测的支原体的种类是 27 种，而 PCR 检测方法检测的是常见的 13 种支原体。样品中污染的支原体可能不包括在 PCR 法检测的支原体种类内。

Q：巢式 PCR 法和一步法恒温支原体检测试剂盒他们的优势在哪些方面，怎么选择？

A：PCR 法的灵敏度高于一步法检测，而一步法的灵敏度是 10^3 个拷贝才能检测出来。一步法检测的细胞支原体种类达 20 多种多于 PCR 法。

Q：GMyc-PCR 支原体检测结果如何判断？

A：GMyc-PCR 支原体检测方法通过巢式 PCR 的方式获得检测结果。整个实验由 2 轮PCR 组成，检测结果以第二轮为准。

Q：说明书中写的是不加loading buffer，直接点样就可以，我点样之后所哟有样品均没有条带（包含阳性对照），阳性对照加了loading buffeer才有条带。

A： 经确定客户配胶的时候未加入EB染料，他们的染料是加在loading buffer中的，所以不加入自己的loading buffer跑不出条带。

EB加入方式：

      1.如果配琼脂糖凝胶的时候加入EB染料，跑胶的的样品中不需要加入了

      2.如果配琼脂糖凝胶的时候未加入EB染料，跑胶的的样品中需要加入EB染料

Q：阳性对照是哪种支原体呢？

A：猪鼻子支原体

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