神经元示踪剂固蓝fast blue 74749-42-1


神经元示踪剂固蓝fast blue 74749-42-1

简要描述:固蓝(Fast blue,FB)FB系水溶性染料,其颗粒较细密,易于被神经轴索摄取,所以标记神经纤维或胞体多于其他染料,易于从标记细胞内扩散到周围组织,照射时褪色较快,即使保存在低温、避光条件下,仍不能长期保存。对需要标记后较长时间的观察,或需分离培养神经元细胞进行实验研究则不太理想。

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固蓝(Fast blue,FB)FB系水溶性染料,其颗粒较细密,易于被神经轴索摄取,所以标记神经纤维或胞体多于其他染料,易于从标记细胞内扩散到周围组织,照射时褪色较快,即使保存在低温、避光条件下,仍不能长期保存。对需要标记后较长时间的观察,或需分离培养神经元细胞进行实验研究则不太理想。

Fast Blue,产品目录编号 # 17740
•Fast blue是一种广泛用作神经元示踪剂的荧光染料,其是一种亲水性的逆行性示踪剂。
•常用于神经生物学研究所
•由于发光时间更长,因而Fast Blue是zui广泛使用的神经元示踪剂。
•激发波长: 365nm 释放波长:420nm
•可溶于:水、低碳数醇类

产品订购信息:

17740-5 Fast Blue   15827 5mg polysiences
17740-2 Fast Blue   7446 2mg polysiences
17740-1 Fast Blue   4131 1mg polysiences

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Protein A+G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2055-50ml)

Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP)
Protein A+G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2055-50ml) 一键复制产品信息

产品编号: P2055-50ml

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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
P2055-2ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 2ml 169.00元
P2055-10ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 10ml 722.00元
P2055-50ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 50ml 2992.00元

本Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP)主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP),也可以用于抗体的纯化。
Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁表面蛋白,分子量为42kDa;Protein G是C型或G型链球菌(Streptococcal bacteria)表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似,能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)结合,结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区,但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合,而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时,两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶(agarose)以一定的方式结合,可用于免疫沉淀或抗体的纯化。
Protein A+G Agarose适合于免疫沉淀所有Protein A Agarose和Protein G Agarose单独可以免疫沉淀的抗体,包括human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,rat IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c,rabbit IgG,rabbit、goat多克隆抗体。下表是碧云天Protein A、Protein G、Protein A+G Agarose产品与人、小鼠、大鼠常见的免疫球蛋白亚类的结合能力及不同物种的总结合能力情况表。

Species Ig Protein A Protein G A+G
Human IgG1 ++++ ++++ ++++
IgG2 ++++ ++++ ++++
IgG3 ++++ ++++
IgG4 ++++ ++++ ++++
IgA ++ ++
IgD ++ ++
IgE ++ ++
IgM ++ ++
Mouse IgG1 + ++++ ++++
IgG2a ++++ ++++ ++++
IgG2b +++ +++ +++
IgG3 ++ +++ +++
IgM +/- +/-
Rat IgG1 + +
IgG2a ++++ ++++
IgG2b ++ ++
IgG2c + ++ ++
IgM +/- +/-
Total Ig Protein A Protein G A+G
Human ++++ ++++ ++++
Mouse +++ +++ +++
Rat +/- ++ ++
Rabbit ++++ +++ ++++
Goat ++ ++
Chicken + +
Cow ++ ++++ ++++
Guinea Pig ++++ ++ ++++
Hamster + ++ ++
Horse ++ ++++ ++++
Pig +++ +++ +++
Sheep +/- ++ ++
++++: Strong Binding
++~+++: Medium Binding
+: Weak Binding
+/-: Weak or No Binding
-: No Binding

本产品中的重组Protein A和Protein G可与多数哺乳动物IgG的Fc端特异性结合,分子量分别为14kDa和22KDa。该重组Protein A和Protein G通过改造,仅保留了与IgG Fc端结合相关的氨基酸序列,去除了结合位点以外可能导致非特异性结合的序列,从而可以有效减少非特异性结合。每个Protein A分子和Protein G分子可分别结合2个和3个IgG分子。
本产品中的Protein A和Protein G共价连接到4%的高交联度、高流速琼脂糖(cross-linked, 4% Agarose, Fast Flow)上,并按1:1比例混合。每毫升Protein A+G agarose beads (沉淀物)中偶联有约10mg的重组Protein A和1mg的Protein G。每毫升Protein A+G agarose beads (沉淀物)可以结合超过25mg human IgG。本产品中agarose beads的平均直径为90μm,抗体纯化时的推荐线性流速为50-300cm/h,耐压指数最高为0.3MPa。
本产品配制在可以直接用于免疫沉淀和抗体纯化的适当溶液中,每毫升中共含有0.25ml agarose beads (沉淀物)。
本Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP)如果用于常规的免疫沉淀,每毫升本产品(沉淀和溶液为1:3的混合物)可以免疫沉淀50次。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
P2055-2ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 2ml
P2055-10ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 10ml
P2055-50ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 50ml
说明书 1份

保存条件:
4℃保存,一年有效。请勿冷冻。
注意事项:
请勿冷冻保存本产品。
Protein A+G Agarose使用前一定要充分重悬,即充分颠倒若干次使混合均匀。
本产品含有微量防腐剂,不会影响常规的免疫沉淀和抗体纯化。但如果后续涉及酶活性测定,使用本产品前宜先用TBS等适当溶液洗涤Protein A+G agarose beads三次,以充分消除防腐剂可能产生的干扰。
从蛋白样品收集开始,所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
a. 蛋白样品的准备:
(a) 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。
(b) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
(c) 对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
b. 去除非特异性结合(可选做)
(a) 取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein A+G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
(b) 2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。
注:所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG,可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。
c. 免疫沉淀:
(a) 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。
(b) 再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose,4℃缓慢摇动1-3个小时(为方便后续的洗涤操作,可以把加入充分重悬的Protein A+G Agarose的量调整为40微升)。
(c) 2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G 
Agarose。
(d) 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤(c)。
(e) 完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1X SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。
(f) 100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀:
参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
3. 抗体纯化:
a. 准备工作:
(a) 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
(b) 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
(c) 选择适当的纯化柱,用适当量的Protein A+G Agarose装填纯化柱。也可使用碧云天的预装柱产品(P2028、P2029)。
(d) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱,流速可以用恒流泵控制为1ml/min (1ml预装柱)。如无恒流泵,也可以完全依靠重力洗涤并平衡纯化柱。
b. 抗体纯化:
(a) 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
(b) 待纯化的抗体过柱后,用10-20倍柱体积的TBS洗涤,以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。
(c) 洗涤完后,用10ml 50mM glycine,pH2.7作为洗脱液,洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein A+G的结合能力很强,在pH2.7时洗脱效果不太理想,可以使用50mM glycine,pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体,根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
c. 纯化柱的再生:
(a) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱,使纯化柱达到中性的pH。
(b) 用TBS来保存再生的纯化柱。

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产品编号 产品名称 包装
P2006 Protein A Agarose (Fast Flow, 进口分装) 2ml
P2009 Protein G Agarose (Fast Flow, 进口分装) 2ml
P2012 Protein A+G Agarose (Fast Flow, 进口分装) 2ml
P2015-2ml Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 2ml
P2015-10ml Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 10ml
P2015-50ml Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 50ml
P2017-2ml Protein G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 2ml
P2017-10ml Protein G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 10ml
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P2019-2ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 2ml
P2019-10ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 10ml
P2019-50ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 50ml
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P2051-2ml Protein A Agarose (Fast Flow, for IP) 2ml
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P2051-50ml Protein A Agarose (Fast Flow, for IP) 50ml
P2053-2ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 2ml
P2053-10ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 10ml
P2053-50ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 50ml
P2055-2ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 2ml
P2055-10ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 10ml
P2055-50ml Protein A+G Agarose (Fast Flow, for IP) 50ml

Protein A+G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2055-50ml)
Protein A+G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2055-50ml)

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Protein A+G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2055-50ml)

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使用本产品的文献:

1. Chen Y, Zhu E, Fan S, Ding H, Ma S, Zhu M, Deng S, Chen J, Zhao M
Important roles of C-terminal residues in degradation of capsid protein of classical swine fever virus.
Virol J. 2019 Nov 6;16(1):127. (IF 2.579)

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的荧光定量qPCR模块,为补充试剂。

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 25

3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)

本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

4 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

5 qPCR反应程序(常规)

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

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Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的荧光定量qPCR模块,为补充试剂。

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 25

3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)

本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

4 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

5 qPCR反应程序(常规)

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct qPCR set (for probe)

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Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)

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COA

已发表文献

 

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行RNA提取(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5小时就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为染料法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的反转录模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16812ES40

16812ES60

16812-A

4× Hifair® FCD RT Mix

200 μL

500 μL

16812-B

RNase Free H2O

2 mL

5 mL

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期6个月。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 104,该试剂盒可使用范围是1 × 103 – 1 × 106 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2-5 μl,最大不超过反应体系的45%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

55℃

15 min

85℃

5 min

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用55℃,对于高GC含量模板或者复杂模板,可将反转录温度提高到 60℃。反转录产物可直接进行下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix

10

Forward Primer (10 μM)

0.4

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.4

200 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

3 qPCR反应体系

*反转录产物的加入量不要超过RT-qPCR体积的1/10。高浓度模板易导致非特异扩增,适当稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL,尽量不要超过6 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序(推荐)

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)10 sec

35-40

退火/延伸

60℃

30 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

4 qPCR反应程序(常规)

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序

实验条件允许时,也可使用快速程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)5 sec

40

退火/延伸**

60℃

10 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

5 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

 

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)

暂无内容

 

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行RNA提取(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5小时就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为染料法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的反转录模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16812ES40

16812ES60

16812-A

4× Hifair® FCD RT Mix

200 μL

500 μL

16812-B

RNase Free H2O

2 mL

5 mL

 

储存条件

长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期6个月。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 104,该试剂盒可使用范围是1 × 103 – 1 × 106 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2-5 μl,最大不超过反应体系的45%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

55℃

15 min

85℃

5 min

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用55℃,对于高GC含量模板或者复杂模板,可将反转录温度提高到 60℃。反转录产物可直接进行下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix

10

Forward Primer (10 μM)

0.4

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.4

200 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

3 qPCR反应体系

*反转录产物的加入量不要超过RT-qPCR体积的1/10。高浓度模板易导致非特异扩增,适当稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL,尽量不要超过6 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序(推荐)

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)10 sec

35-40

退火/延伸

60℃

30 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

4 qPCR反应程序(常规)

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序

实验条件允许时,也可使用快速程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)5 sec

40

退火/延伸**

60℃

10 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

5 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

 

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)

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快速末端修复/A尾添加模块|Hieff NGS®Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module

快速末端修复/A尾添加模块|Hieff NGS®Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品描述

Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module是针对Illumina®高通量测序平台文库构建而专业设计的DNA末端修复/A尾添加模块,具有高效、快速、易实现自动化的优势。本产品兼容1 ng-1 μg片段化Input DNA,可在单管内实现片段化DNA的末端补平、5'端磷酸化和3'端加A尾反应,得到5'末端含磷酸基团且3'末端带有dA突出的DNA产物。该产物无需纯化,即可使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module(Cat#12607)进行文库构建接头连接反应。

本产品已与Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module(Cat#12607),2×Hieff Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix for Library Amplification(Cat#12620)共同用于DNA文库构建,通过Illumina®高通量平台测序验证其有效性。本产品中提供的所有试剂组分均经过严格质检,最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

 

产品组分

组分编号

组分名称

24 T

96 T

12608-A

End Repair/dA-Tailing Buffer

144 μL

576 μL

12608-B

End Repair/dA-Tailing Enzyme

96 μL

384 μL

 

测序验证

本品与Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module(Cat#12607),2×Hieff Canace® High-Fidelity Mix for Library Amplification(Cat#12620)共同用于DNA文库构建,已通过Illumina®高通量平台测序验证其有效性。

 

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存,有效期1年。

 

注意事项 

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 本产品仅用作科研用途!

 

使用方法

1. 将表1中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表1所示反应体系。

表1 末端修复/dA尾添加PCR反应体系

名称

体积(μL)

Fragmented   DNA

x

End Repair/dA-Tailing Buffer

6

End Repair/dA-Tailing Enzyme

4

ddH2O

Up   to 60 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表2所示反应程序,进行末端修复/dA尾添加反应。

表2 末端修复/dA尾添加PCR反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

30°C

20   min

72°C

20   min

4°C

Hold

5. 产物如需纯化,可使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)或AMPure XP Beads(Cat#A63880)或其他等效产品。

 

HB220728

快速末端修复/A尾添加模块|Hieff NGS®Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module

暂无内容

[1]Ma CJ, Li L, Shao WX, et al. An enzyme-mediated bioorthogonal labeling method for genome-wide mapping of 5-hydroxymethyluracil. Chem Sci. 2021;12(42):14126-14132. Published 2021 Oct 4. doi:10.1039/d1sc03812e(IF:9.969)

[2]Zhou W, Yang B, Zou Y, et al. Screening of Compounds for Anti-tuberculosis Activity, and in vitro and in vivo Evaluation of Potential Candidates. Front Microbiol. 2021;12:658637. Published 2021 Jun 30. doi:10.3389/fmicb.2021.658637(IF:6.064)

 

产品描述

Hieff NGS® Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module是针对Illumina®高通量测序平台文库构建而专业设计的DNA末端修复/A尾添加模块,具有高效、快速、易实现自动化的优势。本产品兼容1 ng-1 μg片段化Input DNA,可在单管内实现片段化DNA的末端补平、5'端磷酸化和3'端加A尾反应,得到5'末端含磷酸基团且3'末端带有dA突出的DNA产物。该产物无需纯化,即可使用Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module(Cat#12607)进行文库构建接头连接反应。

本产品已与Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module(Cat#12607),2×Hieff Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix for Library Amplification(Cat#12620)共同用于DNA文库构建,通过Illumina®高通量平台测序验证其有效性。本产品中提供的所有试剂组分均经过严格质检,最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

 

产品组分

组分编号

组分名称

24 T

96 T

12608-A

End Repair/dA-Tailing Buffer

144 μL

576 μL

12608-B

End Repair/dA-Tailing Enzyme

96 μL

384 μL

 

测序验证

本品与Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module(Cat#12607),2×Hieff Canace® High-Fidelity Mix for Library Amplification(Cat#12620)共同用于DNA文库构建,已通过Illumina®高通量平台测序验证其有效性。

 

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存,有效期1年。

 

注意事项 

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 本产品仅用作科研用途!

 

使用方法

1. 将表1中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表1所示反应体系。

表1 末端修复/dA尾添加PCR反应体系

名称

体积(μL)

Fragmented   DNA

x

End Repair/dA-Tailing Buffer

6

End Repair/dA-Tailing Enzyme

4

ddH2O

Up   to 60 μL

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表2所示反应程序,进行末端修复/dA尾添加反应。

表2 末端修复/dA尾添加PCR反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

30°C

20   min

72°C

20   min

4°C

Hold

5. 产物如需纯化,可使用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)或AMPure XP Beads(Cat#A63880)或其他等效产品。

 

HB220728

快速末端修复/A尾添加模块|Hieff NGS®Fast-Pace End Repair/dA-Tailing Module

暂无内容

[1]Ma CJ, Li L, Shao WX, et al. An enzyme-mediated bioorthogonal labeling method for genome-wide mapping of 5-hydroxymethyluracil. Chem Sci. 2021;12(42):14126-14132. Published 2021 Oct 4. doi:10.1039/d1sc03812e(IF:9.969)

[2]Zhou W, Yang B, Zou Y, et al. Screening of Compounds for Anti-tuberculosis Activity, and in vitro and in vivo Evaluation of Potential Candidates. Front Microbiol. 2021;12:658637. Published 2021 Jun 30. doi:10.3389/fmicb.2021.658637(IF:6.064)

 

Fast Pfu DNA 聚合酶


Fast Pfu DNA 聚合酶

简要描述:Fast Pfu DNA 聚合酶

详细介绍

产品咨询

目录号 规格 备注 价格 说明书下载
E031-01A 250U 含dNTP 360元
E031-01B A包装×5 含dNTP 1620元
E031-02A 250U 不含dNTP  310元
E031-02B A包装×5 不含dNTP  1395元

 

· 制品内容 (250 U)

Fast Pfu DNA聚合酶(5 U/μl) 50 μl
dNTP 混合液 (各10 mM) 250 μl
5 × Fast Pfu Buffer with Mg2+ 2000 μl

 

· 制品说明
Pfu DNA聚合酶为zui常用的高保真DNA聚合酶,在需高保真的PCR反应中广范使用,然而Pfu酶扩增灵敏度不高,延伸速度缓慢(0.5kb/分钟)给众多的使用者带来了不便。针对普通Pfu酶的以上缺点,SinoBio采用分子进化技术对普通Pfu酶进行改造,制备的新型聚合酶Fast Pfu酶具有快速、高灵敏度、抗干扰能力强等特点,是新一代的高保真DNA聚合酶。使用Fast Pfu能获得更理想的扩增结果,并大幅度缩短扩增反应时间。

· 用 途
用于要求保真度比较高的PCR反应,包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突变、全基因合成等(参见 SinoBio 实验方案)。

· 产品特点
高保真:具有同Pfu酶相同的保真度,为普通Taq酶的10倍。
快速:Fast Pfu扩增速度为普通Pfu酶的数倍,72℃保温30秒可延伸1kb以上。
高效:以λDNA为模板,扩增长度可达12kb,能高效扩增≤6kb片段;对于人基因组DNA等复杂模板,能有效扩增出3kb特定基因片段。
*配方的5×Buffer:使PCR扩增反应更加稳定、灵敏、高效。

· 质量保证
经多次柱纯化,SDS-PAGE胶检测仅可见清晰单一的目的条带;PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留,无核酸内、外切酶污染。

· 使用建议

Fast Pfu DNA聚合酶产生的PCR产物为平滑末端,无3’端”A”突出, 其PCR产物的克隆有两种方案:
1.PCR前引物进行5’端加磷修饰或将PCR产物磷酸化处理后再直接克隆于平滑末端的载体中(参见 Sinobio 实验方案)。
2.将产物3’末端加A后再与T-Vector连接(参见 SinoBio 实验方案)。

*由于Fast Pfu DNA聚合酶的校对活性可引起引物从3′端被部分降解。因此在设计引物时应适当增加引物的长度,理想的引物长度为 20-30碱基。另外为了减少由3′-5′外切酶活性引起的引物降解, 尽量在冰上配置反应体系,并zui后加入Fast Pfu酶。。

· 相关图片

 

· 其他说明

 

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行RNA提取(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5小时就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为染料法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的细胞裂解模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16811ES40

16811ES60

16811-A

FCD Lysis Buffer

2 mL

5 mL

16811-B

FCD Washing Buffer

8 mL

20 mL

16811-C

FCD Stop Solution

100 μL

250 μL

16811-D

DNase I

80 μL

200 μL

 

储存条件

16811-A和 16811-B未开封时请置于-25~-15℃保存,融解后置于4℃保存,注意防止污染,其余组分长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期6个月。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 104,该试剂盒可使用范围是1 × 103 – 1 × 106 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2-5 μl,最大不超过反应体系的45%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

55℃

15 min

85℃

5 min

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用55℃,对于高GC含量模板或者复杂模板,可将反转录温度提高到 60℃。反转录产物可直接进行下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix

10

Forward Primer (10 μM)

0.4

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.4

200 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

3 qPCR反应体系

*反转录产物的加入量不要超过RT-qPCR体积的1/10。高浓度模板易导致非特异扩增,适当稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL,尽量不要超过6 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序(推荐)

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)10 sec

35-40

退火/延伸

60℃

30 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

4 qPCR反应程序(常规)

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序

实验条件允许时,也可使用快速程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)5 sec

40

退火/延伸**

60℃

10 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

5 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

 

 

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)

暂无内容

 

Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行RNA提取(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5小时就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为染料法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的细胞裂解模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16811ES40

16811ES60

16811-A

FCD Lysis Buffer

2 mL

5 mL

16811-B

FCD Washing Buffer

8 mL

20 mL

16811-C

FCD Stop Solution

100 μL

250 μL

16811-D

DNase I

80 μL

200 μL

 

储存条件

16811-A和 16811-B未开封时请置于-25~-15℃保存,融解后置于4℃保存,注意防止污染,其余组分长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期6个月。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 104,该试剂盒可使用范围是1 × 103 – 1 × 106 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2-5 μl,最大不超过反应体系的45%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

55℃

15 min

85℃

5 min

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用55℃,对于高GC含量模板或者复杂模板,可将反转录温度提高到 60℃。反转录产物可直接进行下游RT-qPCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix

10

Forward Primer (10 μM)

0.4

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.4

200 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

3 qPCR反应体系

*反转录产物的加入量不要超过RT-qPCR体积的1/10。高浓度模板易导致非特异扩增,适当稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL,尽量不要超过6 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序(推荐)

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

30 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)10 sec

35-40

退火/延伸

60℃

30 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

4 qPCR反应程序(常规)

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序

实验条件允许时,也可使用快速程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)5 sec

40

退火/延伸**

60℃

10 sec

熔解曲线阶段

仪器默认设置

1

5 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

 

 

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for sybr)

暂无内容

10×快速转膜液(10×Fast Transfer buffer) 高效蛋白转膜

10×快速转膜液(10×Fast Transfer buffer) 高效蛋白转膜

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

10×快速转膜液(10×Fast Transfer buffer)是一款高效蛋白转膜产品可应用于湿转法转膜或者半干法转膜,能高效快速地将PAGE凝胶上的蛋白转移至PVDF膜或NC膜上,转移过程所产生的热量远远小于普通转膜缓冲液,无需额外冰水浴,并且可以同时进行小分子量和大分子量的蛋白转印。

本产品安全无毒害,使用前仅需用水和乙醇稀释至(能在15-35分钟内快速完成转膜全过程)。

 

产品特点

1.本产品转膜效率高,能在15-35分钟内快速完成转膜过程。

2.稳定性高,产热量小,减少对蛋白的损失。

3.兼容性好,对分子量跨度大的蛋白同样适用,有效解决大小蛋白不能在同一张膜上同时转移的问题兼容Tris-Gly体系、Hepes体系、Bis-Tris体系等多种凝胶。

 

运输和保存方法

冰袋运输。28保存,有效期1年;

 

使用方法

1.1×快速转膜的配制:取 10×快速转膜液100 mL+ 去离子水(700 mL+ 无水乙醇(200 mL),混匀备用。

2.准备转印膜及凝胶,并组装好转印设备。

3.转印槽中加入1×快速转膜,设定恒流 400 mA,开始转印。

 

注意事项

1.当转膜液长时间在2-8℃存放,若出现沉淀,可在水浴锅中温育并充分溶解后继续使用。

2.注意在使用乙醇时,不要求必须使用无水乙醇,如使用含水乙醇,请按照试剂中乙醇实际浓度计算加入量。

3.湿转转膜时电转仪外无需额外冰浴,即可确保无过热现象,如若希望更为快速地完成转膜,可使用400mA 或更高的电流进行恒流转膜。

4.为了您的安全和健康请穿实验服并戴一次性手套操作

5.本产品仅作科研用途!

 

HB220817

Q1:可以回收重复利用吗?

A:可以,回收后可以再使用1-2次

Q1:产品是用水和乙醇配制,不是用水和甲醇配制吗?

A:PVDF膜活化最好还是用甲醇,至于转膜液中目前基本可以用乙醇代替甲醇(因为甲醇相对没有乙醇安全),但如果客户还是想用甲醇的话,还是可以的.

10×快速转膜液(10×Fast Transfer buffer) 高效蛋白转膜

暂无内容

 

10×快速转膜液(10×Fast Transfer buffer)是一款高效蛋白转膜产品可应用于湿转法转膜或者半干法转膜,能高效快速地将PAGE凝胶上的蛋白转移至PVDF膜或NC膜上,转移过程所产生的热量远远小于普通转膜缓冲液,无需额外冰水浴,并且可以同时进行小分子量和大分子量的蛋白转印。

本产品安全无毒害,使用前仅需用水和乙醇稀释至(能在15-35分钟内快速完成转膜全过程)。

 

产品特点

1.本产品转膜效率高,能在15-35分钟内快速完成转膜过程。

2.稳定性高,产热量小,减少对蛋白的损失。

3.兼容性好,对分子量跨度大的蛋白同样适用,有效解决大小蛋白不能在同一张膜上同时转移的问题兼容Tris-Gly体系、Hepes体系、Bis-Tris体系等多种凝胶。

 

运输和保存方法

冰袋运输。28保存,有效期1年;

 

使用方法

1.1×快速转膜的配制:取 10×快速转膜液100 mL+ 去离子水(700 mL+ 无水乙醇(200 mL),混匀备用。

2.准备转印膜及凝胶,并组装好转印设备。

3.转印槽中加入1×快速转膜,设定恒流 400 mA,开始转印。

 

注意事项

1.当转膜液长时间在2-8℃存放,若出现沉淀,可在水浴锅中温育并充分溶解后继续使用。

2.注意在使用乙醇时,不要求必须使用无水乙醇,如使用含水乙醇,请按照试剂中乙醇实际浓度计算加入量。

3.湿转转膜时电转仪外无需额外冰浴,即可确保无过热现象,如若希望更为快速地完成转膜,可使用400mA 或更高的电流进行恒流转膜。

4.为了您的安全和健康请穿实验服并戴一次性手套操作

5.本产品仅作科研用途!

 

HB220817

Q1:可以回收重复利用吗?

A:可以,回收后可以再使用1-2次

Q1:产品是用水和乙醇配制,不是用水和甲醇配制吗?

A:PVDF膜活化最好还是用甲醇,至于转膜液中目前基本可以用乙醇代替甲醇(因为甲醇相对没有乙醇安全),但如果客户还是想用甲醇的话,还是可以的.

10×快速转膜液(10×Fast Transfer buffer) 高效蛋白转膜

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

 

Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的细胞裂解模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16814ES40

16814ES60

16814-A

FCD Lysis Buffer

2 mL

5 mL

16814-B

FCD Washing Buffer

8 mL

20 mL

16814-C

FCD Stop Solution

100 μL

250 μL

16814-D

DNase I

80 μL

200 μL

 

储存条件

16814-A和 16814-B未开封时请置于-25~-15℃保存,融解后置于4℃保存,注意防止污染,其余组分长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 25

3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)

本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

4 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

5 qPCR反应程序(常规)

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)

暂无内容

 

Hieff® Fast Cell Direct Probe RT-qPCR Kit 适用于对各种动物细胞进行基因定量表达分析(如cell line 化的贴壁细胞和悬浮细胞、原代培养细胞、各种干细胞、iPS 细胞等),无需提RNA,可直接进行qPCR表达分析,用时短,操作简单,出错率低,最短只需1.5 h就可高效完成从模板制备到反转录反应及基因表达分析等步骤。该产品为探针法细胞直扩RT-qPCR试剂盒的细胞裂解模块,为补充试剂。

 

组分信息

组分编号

组分名称

16814ES40

16814ES60

16814-A

FCD Lysis Buffer

2 mL

5 mL

16814-B

FCD Washing Buffer

8 mL

20 mL

16814-C

FCD Stop Solution

100 μL

250 μL

16814-D

DNase I

80 μL

200 μL

 

储存条件

16814-A和 16814-B未开封时请置于-25~-15℃保存,融解后置于4℃保存,注意防止污染,其余组分长期保存时请于-25~-15℃保存,有效期1年。

 

使用说明

一、裂解产物的制备

  1. 将试剂放置室温下融化,使用前上下颠倒,轻轻混匀,并轻微离心后使用,避免起泡。没有混匀试剂、使用振荡器混匀、未在冰上配置试剂等会导致反应性能下降。
  2. 将细胞转移至离心管中*,5000 rpm离心2 min收集细胞**,充分吸除培养基。若贴壁细胞在96孔板中培养,可直接吸除培养基。
  3. 各个孔内加入FCD Washing Buffer 150 μL,吸打清洗细胞,5000 rpm离心2 min,吸尽FCD Washing Buffer。
  4. 各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,2 μL DNase I溶液,室温吸打混匀后静置5 min,孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混匀5次左右,即可得到裂解产物****,细胞数量超过1× 105 cells时可能会有裂解残留物属正常现象。

*50 μL裂解体系适配细胞数的基本要求是每孔1× 102 – 1× 105 cells,若细胞数量较多,可适当等比例增加FCD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量。

**不同细胞的离心条件不同,请使用适合于所用细胞的离心速度进行离心。

***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution。依实验需要,加入裂解液量增大时需相应增大FCD Stop Solution的量。

****细胞裂解产物溶液长期保存时,请置于-25~-15

二、反转录

  1. 室温融化4× Hifair® FCD RT Mix后轻微颠倒混匀,置于冰上并按下表配置反应体系:

组分

体积 μL

终浓度

4× Hifair® FCD RT Mix

5

裂解产物*

x

RNase-free H2O

Up to 20

1 反转录反应体系

*避免吸入细胞碎片,推荐使用量为2 μl,最大不超过反应体系的55%。

  1. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,按下表程序进行反转录反应**:

反应温度

反应时间

37℃

5 min

85℃

5 sec

2 反转录反应程序

**反转录温度推荐使用37℃,反转录产物可直接进行下游qRT-PCR检测。为避免反转录体系对qPCR反应的抑制,得到合适的Ct值(10-35),可将产物稀释10-1000倍后使用。若短时间内不进行下游实验,可放置于-25~-15保存。

三、荧光定量PCR

  1. 体系配置

使用下列组份比例配制反应液(配制过程请于冰上进行):

组分

体积(μL)

终浓度

2× Hieff® FCD Probe qPCR Mix

12.5

Forward Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Reverse Primer (10 μM)

0.5

200 nM

Probe (10 μM)

0.25-1

100-400 nM

反转录产物*

x

RNase-free H2O

Up to 25

3 qPCR反应体系

*高浓度模板易导致非特异扩增,可适当将模板稀释5-50倍。模板推荐用量4 μL。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物探针浓度。

  1. 荧光定量PCR快速扩增程序(推荐)

本产品推荐使用快速程序扩增,可大大减少反应时间。使用Tm值较低的引物难以扩增时,可额外调整退火温度。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)5 sec

45

退火/延伸**

60℃

10 sec

4 qPCR反应程序(快速)

**退火/延伸温度、终延伸时间可根据实验要求适当调整。 快速程序适用于绝大多数基因,个别复杂二级结构基因可尝试常规程序。

  1. 荧光定量PCR常规扩增程序

实验仪器不满足快速反应时间时,也可使用常规程序进行扩增。

循环步骤

温度

时间

循环数

预变性

95℃

10 sec

1

变性

95℃

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)15 sec

40-45

退火/延伸**

60℃

30 sec

5 qPCR反应程序(常规)

 

注意事项

  1. 使用前,将冻存的各组分充分融解并轻轻混匀后使用。
  2. 实验时,请尽量使用无污染的耗材,避免污染。
  3. 本产品避免反复冻融,配制时应避免强光照射。
  4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
  5. 本产品仅作科研用途!

Ver.CN20231207

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)

暂无内容

Hieff® Fast Cell Direct Lysis set (for probe)

暂无内容

Protein G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2053-50ml)

Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)
Protein G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2053-50ml) 一键复制产品信息

产品编号: P2053-50ml

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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
P2053-2ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 2ml 168.00元
P2053-10ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 10ml 718.00元
P2053-50ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 50ml 2970.00元

本Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP),也可以用于抗体的纯化。
Protein A是一种发现于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁表面蛋白,分子量为42kDa;Protein G是C型或G型链球菌(Streptococcal bacteria)表达的免疫球蛋白结合蛋白。Protein A和Protein G功能相似,能特异性地与哺乳动物免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)结合,结合的部位通常为免疫球蛋白的Fc区,但有资料显示Protein A也会和人VH3家族的Fab区结合,而Protein G有时与Fab区也有一定结合。同时,两者对于不同的免疫球蛋白亚类的结合能力有所不同。适当重组改造的Protein A、G与琼脂糖凝胶(agarose)以一定的方式结合,可用于免疫沉淀或抗体的纯化。
Protein G Agarose适合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG3、IgG4,mouse IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,rat IgG1、IgG2a、IgG2b、 IgG2c,以及rabbit、goat多克隆抗体。下表是碧云天Protein A、Protein G、Protein A+G Agarose产品与人、小鼠、大鼠常见的免疫球蛋白亚类的结合能力及不同物种的总结合能力情况表。

Species Ig Protein A Protein G A+G
Human IgG1 ++++ ++++ ++++
IgG2 ++++ ++++ ++++
IgG3 ++++ ++++
IgG4 ++++ ++++ ++++
IgA ++ ++
IgD ++ ++
IgE ++ ++
IgM ++ ++
Mouse IgG1 + ++++ ++++
IgG2a ++++ ++++ ++++
IgG2b +++ +++ +++
IgG3 ++ +++ +++
IgM +/- +/-
Rat IgG1 + +
IgG2a ++++ ++++
IgG2b ++ ++
IgG2c + ++ ++
IgM +/- +/-
Total Ig Protein A Protein G A+G
Human ++++ ++++ ++++
Mouse +++ +++ +++
Rat +/- ++ ++
Rabbit ++++ +++ ++++
Goat ++ ++
Chicken + +
Cow ++ ++++ ++++
Guinea Pig ++++ ++ ++++
Hamster + ++ ++
Horse ++ ++++ ++++
Pig +++ +++ +++
Sheep +/- ++ ++
++++: Strong Binding
++~+++: Medium Binding
+: Weak Binding
+/-: Weak or No Binding
-: No Binding

本产品中的重组Protein G可与多数哺乳动物IgG的Fc端特异性结合,分子量为22kDa。该重组Protein G通过改造,仅保留了与IgG Fc端结合相关的氨基酸序列,去除了结合位点以外可能导致非特异性结合的序列(如白蛋白结合位点),从而可以有效减少非特异性结合。每个Protein G分子可以结合3个IgG。
本产品中的Protein G共价连接到4%的高交联度、高流速琼脂糖(cross-linked, 4% Agarose, Fast Flow)上。每毫升Protein
G agarose beads (沉淀物)中共偶联有约2mg的重组Protein G。每毫升Protein G agarose beads (沉淀物)可以结合超过20mg human IgG。本产品中agarose beads的平均直径为90μm,抗体纯化时的推荐线性流速为50-300cm/h,耐压指数最高为0.3MPa。
本产品配制在可以直接用于免疫沉淀和抗体纯化的适当溶液中,每毫升中共含有0.25ml agarose beads (沉淀物)。
本Protein G Agarose (Fast Flow, for IP)如果用于常规的免疫沉淀,每毫升本产品(沉淀和溶液为1:3的混合物)可以免疫沉淀50次。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
P2053-2ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 2ml
P2053-10ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 10ml
P2053-50ml Protein G Agarose (Fast Flow, for IP) 50ml
说明书 1份

保存条件:
4℃保存,一年有效。请勿冷冻。
注意事项:
请勿冷冻保存本产品。
Protein G Agarose使用前一定要充分重悬,即充分颠倒若干次使混合均匀。
本产品中含有微量防腐剂,不会影响常规的免疫沉淀和抗体纯化。但如果后续涉及酶活性测定,使用本产品前宜先用TBS等适当溶液洗涤Protein G Agarose beads三次,以充分消除防腐剂可能产生的干扰。
从蛋白样品收集开始,所有步骤中蛋白样品都必须在4℃或冰上操作。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
a. 蛋白样品的准备:
(a) 对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。
(b) 对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。
(c) 对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。
注:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。
b. 去除非特异性结合(可选做)
(a) 取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。
(b) 2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。
注:所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG,如无normal IgG,可以加入其它不影响后续检测的其它mouse IgG类型的抗体。通过和normal IgG和Protein G Agarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。
c. 免疫沉淀:
(a) 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。
(b) 再加入20微升充分重悬的Protein G Agarose,4℃缓慢摇动1-3个小时(为方便后续的洗涤操作,可以把加入充分重悬的Protein G Agarose的量调整为40微升)。
(c) 2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。
(d) 用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤(c)。
(e) 完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1X SDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。
(f) 100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。
2. 免疫共沉淀:
参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(Co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。
3. 抗体纯化:
a. 准备工作:
(a) 用0.45微米或0.2微米孔径的滤膜过滤所用的溶液。
(b) 所有的溶液必须用超声等方法脱气(degas)。
(c) 选择适当的纯化柱,用适当量的Protein G Agarose装填纯化柱。也可使用碧云天的预装柱产品(P2026、P2027)。
(d) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱,流速可以用恒流泵控制为1ml/min (1ml预装柱)。如无恒流泵,也可以完全依靠重力洗涤并平衡纯化柱。
b. 抗体纯化:
(a) 把含有待纯化的抗体上样到纯化柱。
(b) 待纯化的抗体过柱后,用10-20倍柱体积的TBS洗涤,以去除未结合和非特异性结合的蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。
(c) 洗涤完后,用10ml 50mM glycine,pH2.7作为洗脱液,洗脱结合的抗体。某些抗体和Protein G的结合能力很强,在pH2.7时洗脱效果不太理想,可以使用50mM glycine,pH1.9作为洗脱液。分管收集洗脱下的抗体,根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。
c. 纯化柱的再生:
(a) 用10-20倍柱体积的TBS洗涤纯化柱,使纯化柱达到中性的pH。
(b) 用TBS来保存再生的纯化柱。

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P2015-10ml Protein A Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用) 10ml
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Protein G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2053-50ml)
Protein G Agarose (Fast Flow, 免疫沉淀用)(P2053-50ml)

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1. Zhang M, Gao M, Chen J, Song L, Wei W
CP-25 exerts anti-angiogenic effects on a rat model of adjuvant-induced arthritis by promoting GRK2-induced downregulation of CXCR4-ERK1/2 signaling in endothelial cells.
Mol Med Rep. 2019 Dec;20(6):4831-4842. (IF 2.1)