Eagle Biosciences人完整成纤维细胞生长因子(FGF-21)ELISA
目录号：
F2131-K01（1 × 96孔）
仅供研究使用。不得用于诊断程序。
v. 1.0
EagleBiosciences,Inc.
预期用途
Eagle Biosciences人完整成纤维细胞生长因子21(FGF-21)ELISA检测试剂盒（酶联免疫分析试剂盒）预期用于定量测定血清中人完整成纤维细胞生长因子21(FGF-21)的水平。Eagle Biosciences人完整成纤维细胞生长因子21(FGF-21)ELISA检测试剂盒仅供研究使用，不用于诊断程序。
引言
成纤维细胞生长因子21(FGF-21)属于FGF-19亚家族，包括FGF-19、FGF-21和FGF-23。FGF-19家族成员是调节多种生理稳态的强效内分泌激素。
完整的FGF-21是由181个氨基酸组成的小蛋白。在一系列胰岛素抵抗动物模型中，给予重组FGF21可降低血糖和胰岛素水平，降低肝脏和循环甘油三酯和胆固醇水平，并改善胰岛素敏感性、能量消耗、肝脏脂肪变性和肥胖。FGF-21的生理功能依赖于其N末端和C末端区域的完整分子结构和氨基酸序列。N端截短的FGF-21(7-181)是一种强效抑制剂，可竞争性抑制完整FGF-21(1-181)的生物活性。因此，测量循环完整FGF-21水平在生理和病理生理状况评估中具有重要意义。测定FGF-21片段的试验可能高估供试品中蛋白的生物活性。
循环FGF-21是一种生物标志物，在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和肥胖患者中其水平升高。在库欣综合征患者、HIV-1诱导的脂肪代谢障碍患者和慢性肾病或终末期肾病(ESRD)患者中也发现循环FGF-21增加。
试验原理
Eagle Biosciences人完整成纤维细胞生长因子21(FGF-21)ELISA检测试剂盒的设计、开发和生产用于定量测定血清和EDTA血浆样本中的人完整FGF-21。该试验采用双位点“夹心”技术和与人完整FGF-21不同表位结合的两种选定抗体。其中一种抗体与N-末端人FGF-21(1-7)特异性结合，另一种与C-末端人FGF-21(175-181)特异性结合。
将试验标准品、对照品和患者样本直接加入包被抗人FGF-21(1-7)特异性抗体的微孔板孔中。同时，向各孔中加入辣根过氧化物酶结合的抗人FGF-21(175-181)特异性抗体。一个孵育期后，微量滴定孔壁上的抗体捕获样本中的人FGF-21，并洗去每个微量滴定孔中的未结合蛋白。形成“抗FGF-21抗体人完整FGF-21 HRP结合示踪抗体”的“夹心”。在随后的清洗步骤中除去未结合的示踪抗体。为检测该免疫复合物，将微孔与底物溶液在定时反应中孵育，然后在分光光度酶标仪中测定。与微量滴定孔壁上人完整FGF-21结合的免疫复合物的酶活性与样本中完整FGF-21的量成正比。通过绘制吸光度与相应人完整FGF-21浓度的曲线生成标准曲线
直接根据该标准曲线测定供试品中的FGF-21。
试剂：制备和储存
接收后，该完整成纤维细胞生长因子21(FGF-21)ELISA检测试剂盒必须储存在2-8 ℃下。关于试剂盒的失效日期，请参阅试剂盒包装盒上的标签。所有组分在失效日期前均保持稳定。
使用前使所有试剂恢复至室温。不同试剂盒批号的试剂不得合并或互换。
1. 抗人FGF-21抗体包被微孔板
一个微孔板，含有12 x 8孔可破碎条带（共96孔），包被有人FGF-21抗体。将板框定并密封在含有干燥剂的箔拉链袋中。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。
2. 人FGF-21示踪抗体
一个小瓶含有0.4 mL浓HRP标记的抗人FGF-21抗体（稳定蛋白基质中）。使用前，必须用FGF-21示踪剂抗体稀释剂稀释该试剂。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。
3. FGF-21示踪抗体稀释液
一个含有8 mL即用型缓冲液的小瓶。根据测定程序，应仅用于示踪抗体稀释。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。
4. ELISA清洗浓缩液
每瓶含30 mL 30倍浓缩液。使用前，必须用870 mL去离子水稀释内容物，并混匀。稀释后，得到含有表面活性剂的工作清洗液，溶于含有非叠氮化物、非汞防腐剂的磷酸盐缓冲盐水中。稀释液应在室温下储存，并在试剂盒上显示的失效日期前保持稳定。
5. ELISA HRP底物
一瓶含有12 mL四甲基联苯胺(TMB)和稳定的过氧化氢。该试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。
6. ELISA终止液
每瓶含12 mL 0.5 M硫酸。该试剂应储存在2-8 ℃或室温下，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。
7. 人FGF-21标准品
6个小瓶分别含有不同浓度的人FGF-21，溶于冻干牛血清基质中，基质中含非叠氮化物、非汞防腐剂。各标准品的准确浓度参见小瓶。标准品可直接使用。这些试剂应在2-8 ℃下储存，并在试剂盒包装盒上的失效日期前保持稳定。
8. 人FGF-21对照
两个小瓶分别含有不同浓度的人FGF-21，溶于冻干牛血清基质中，含非叠氮化物、非汞防腐剂。有关各质控品的准确浓度范围，请参见小瓶。质控品准备就绪。两种质控品均应储存在2-8 ℃下，并在试剂盒包装盒上标注的失效日期前保持稳定。
安全注意事项
人完整成纤维细胞生长因子21(FGF-21)检测试剂盒试剂必须在专业实验室环境中使用，且仅供研究使用，不得用于诊断程序。仅牛血清试剂来源的原材料来自美国连续48个国家。仅从兽医监督下饲养的供体健康动物中获得，发现无传染病。进行本试验时佩戴手套，并将这些试剂视为具有潜在传染性进行处理。避免接触含有TMB、过氧化氢或硫酸的试剂。TMB可能会刺激皮肤和粘膜，引起皮肤过敏反应。TMB是一种疑似致癌物。硫酸接触皮肤可能引起严重刺激。请勿接触眼睛、皮肤或衣服。请勿摄入或吸入烟雾。接触后，用大量水冲洗至少15 min。使用药物非临床研究质量管理规范。
需要但未提供的材料
· 能够递送25µL、50µL、100µL和1000µL的精密单通道移液器
· 重复适用于递送100µL的分配器。
· 适用于上述体积分配的一次性移液器吸头。
· 一次性12 x 75 mm或13 x 100玻璃管或塑料管。
· 带盖的一次性100 mL和1000 mL塑料瓶。
· 铝箔。
· 去离子水或蒸馏水。
· 塑料微量滴定孔盖或聚乙烯膜。
· ELISA多通道洗瓶或全自动（半自动）洗涤系统。
· 能够读取450 nm处吸光度的分光光度酶标仪。
样本采集
仅需要50µL人EDTA血浆用于单峰人FGF-21测定。标本采集前无需对个体进行特殊准备。应使用紫色盖的真空采血管采集全血，并通过离心（850-1500xg离心10 min）将血浆与细胞分离。应在采集后立即或至少在采血后1小时内将血浆与细胞分离。离心后应立即将血浆转移至洁净试管中。如果在48小时内不进行测定，血浆样本应储存在-20 ℃下。避免标本冻融循环超过3次。
血清样本也可用于FGF-21测定。血清样本采集应按照样本采集管制造商的建议进行。
样本运输
收集的EDTA-血浆或血清样本应在冷冻条件下用干冰运送至实验室。如果冷冻条件不可用，样本应在
冷藏运输，例如，使用蓝色冰袋运输。
试剂制备
1. 使用前，使所有试剂恢复至室温。不同试剂盒批号的试剂不得组合或互换。
2. 使用前，必须将ELISA清洗浓缩液稀释至工作溶液。详细信息请参见试剂章节。
- 向各小瓶中加入0.5 mL蒸馏水，复溶试剂盒标准品和质控品。使用前轻轻混合并溶解整个颗粒。复溶的标准品和对照品应在使用后立即储存在-20 ℃下。
- 用FGF-21示踪抗体稀释剂（目录号30600）以1:21倍稀释结合抗体，制备工作人FGF-21示踪抗体（目录号30620）。下表概述了使用的试剂条与制备的抗体混合物之间的关系。
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试纸编号。
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FGF-21示踪抗体稀释液
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FGF-21示踪抗体
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1
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500 µL
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25 µL
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2
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1000 µL
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50 µL
|
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3
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1500 µL
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75 µL
|
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4
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2000 µL
|
100 µL
|
|
5
|
2500 µL
|
125 µL
|
|
6
|
3000 µL
|
150 µL
|
|
7
|
3500 µL
|
175 µL
|
|
8
|
4000 µL
|
200 µL
|
|
9
|
4500 µL
|
225 µL
|
|
10
|
5000 µL
|
250 µL
|
|
11
|
5500 µL
|
275 µL
|
|
12
|
6000 µL
|
300 µL
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注：该抗体混合物必须在临检测前新鲜制备。
试验程序
1. 将足够数量的鼠IgG包被微孔板条/孔置于支架中，以一式两份运行人FGF-21标准品、对照品和未知样品。
2. 测试配置
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世界其他地区
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试剂条1
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试剂条2
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试剂条3
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A
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标准品1
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标准品5
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样本1
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|
B
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标准品1
|
标准品5
|
样本1
|
|
C
|
标准品2
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标准品6
|
样本2
|
|
D
|
标准品2
|
标准品6
|
样本2
|
|
E
|
标准品3
|
C 1
|
样品3
|
|
F
|
标准品3
|
C 1
|
样品3
|
3. 向微孔中加入50µL标准品、对照品和患者血浆/血清样本。
4. 向各孔中加入50µL 1:21稀释的示踪抗体
5. 用封板覆膜覆盖微孔板，并在室温下通过定轨振摇170 rpm孵育微孔板2小时。
6. 取下封板膜。吸取各孔内容物。向各孔中加入350µL工作清洗液，清洗各孔5次，然后*吸出内容物。或者，可以使用自动微孔板洗板机。
7. 向各孔中加入100µL ELISA HRP底物。
8. 用封板覆膜覆盖微孔板，同时用铝箔覆盖，避免暴露于光照下。平板在室温下孵育20 min。
9. 取下铝箔和封板膜。向各孔中加入100µL ELISA终止液。轻轻混合。
10. 在酶标仪中读取450/650 nm下10 min内的吸光度
程序注释
1. 建议所有标准品、对照品和未知样品重复测定两次。每份重复样本的平均吸光度读数应用于数据简化和结果计算。
2. 将光敏试剂保存在原始琥珀色瓶中。
3. 将任何未使用的抗体包被条储存在含有干燥剂的箔拉链袋中，以防止受潮。
4. 为确保试验的重现性，必须采用仔细的技术并使用适当校准的移液装置。
5. 除本说明书中规定的孵育时间或温度外，其他孵育时间或温度可能影响结果。
6. 避免微孔中出现气泡，因为这可能导致结合效率较低和重复读数的CV%较高
7. 所有试剂在使用前应轻轻充分混匀。避免起泡。
结果判读
1. 计算每对重复检测结果的平均吸光度。
2. 从所有其他读数的平均吸光度中减去STD 1(0 ng/mL)的平均吸光度，得到校正吸光度。
3. 通过所有标准品的吸光度生成标准曲线。还可使用适当的计算机辅助数据简化程序进行结果计算。
使用各自的校正吸光度，直接从标准曲线读取对照品和患者样本的人完整FGF-21浓度。
示例数据和标准曲线
显示了人完整成纤维细胞生长因子21(FGF-21)ELISA检测试剂盒的典型吸光度数据和所得标准曲线。不得使用该曲线代替每次试验的标准曲线运行。
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孔I.D.
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OD 450/650 nm吸光度
|
结果pg/mL
|
|
|
读数
|
平均值
|
已纠正
|
|
|
0
pg/mL
|
0.037
0.036
|
0.037
|
0.000
|
|
|
32.5
pg/mL
|
0.087
0.086
|
0.087
|
0.050
|
|
|
91
pg/mL
|
0.172
0.169
|
0.170
|
0.133
|
|
|
255
pg/mL
|
0.398
0.399
|
0.399
|
0.302
|
|
|
714
pg/mL
|
1.067
1.069
|
1.068
|
1.031
|
|
|
2000
pg/mL
|
2.835
2.903
|
2.869
|
2.946
|
|
|
对照1
|
0.126
0.129
|
0.127
|
0.371
|
|
|
|
|
|
60.83
|
|
对照2
|
0.736
0.721
|
0.729
|
1.200
|
|
|
|
|
|
481.29
|
预期值
用该人完整FGF-21 ELISA测定32份正常成人血浆样本。发现正常范围小于200 pg/mL。强烈建议各实验室根据正常供体EDTA血浆或血清样本建立自己的正常范围。
程序的局限性
1. 由于没有可用于人完整FGF-21测量的金标准浓度，因此通过与高纯度FGF-21标准品的相关性确定试验标准品的值。
2. 对于读数高于高标准的样本值，建议使用稀释液重新测定样本。
3. 血浆标本或试剂的细菌或真菌污染，或试剂之间的交叉污染可能导致错误的结果。
4. 用聚酯树脂去离子的水可能使辣根过氧化物酶失活。
质量控制
为确保结果的有效性，每项试验应包括具有已知人完整FGF-21水平的适当对照。我们建议，除本试剂盒提供的检测试剂盒外，所有检测试剂盒还包括实验室自己的FGF-21对照。
性能特征
灵敏度(LoD)
通过比20次零标准品重复测定的平均值高2倍标准差的相应OD值测定的该人完整FGF-21 ELISA的灵敏度（低）为1.7 pg/mL。
高剂量“钩状”效应
该试验表明，高达20,000 pg/mL时无任何高剂量“钩状”效应。
精密度
通过在单次测定中测量3份供体EDTA血浆样本（重复测定16次），验证试验内精密度。
|
人完整FGF-
21值(pg/mL)
|
CV (%)
|
|
63.2
|
5.7
|
|
171
|
4.2
|
|
480
|
5.4
|
通过在12次单独试验中一式两份测定3份对照样品，验证试验间精密度。
|
人完整FGF-
21值(pg/mL)
|
CV (%)
|
|
69.8
|
6.9
|
|
181
|
3.0
|
|
486
|
1.9
|
线性
用0.01M PBS(pH 7.4)稀释2份人EDTA血浆样本并进行分析。以pg/mL为单位的结果如下：
|
#
|
稀释
|
观测值
|
预期值
|
回收率
%
|
|
1
|
纯品
|
286
|
–
|
–
|
|
|
1:2
|
138
|
143
|
96
|
|
|
1:4
|
75
|
72
|
104
|
|
|
1:8
|
37.9
|
36
|
105
|
|
|
1:16
|
19.5
|
18
|
108
|
|
2
|
纯品
|
61.8
|
–
|
–
|
|
|
1:2
|
32.1
|
30.9
|
104
|
|
|
1:4
|
15.9
|
15.5
|
103
|
|
|
1:8
|
7.2
|
7.7
|
94
|
加标回收率
向两份患者样本中加标不同量的人完整FGF-21(1 vol. + 1 vol.)。混合物）并测定。结果单位为ng/mL，如下所示：
|
#
|
初始值
|
加标量
|
观察值
|
预期值
|
恢复
%
|
|
1
|
45.9
|
91
|
64.9
|
68.5
|
95
|
|
|
（血清）
|
255
|
150
|
151
|
100
|
|
|
|
714
|
388
|
380
|
102
|
|
2
|
40.4
|
91
|
71.2
|
65.7
|
108
|
|
|
（血浆）
|
255
|
148
|
148
|
100
|
参考文献
- Yie J等人FGF21 N端和C端在受体相互作用和活化中发挥不同的作用。FEBS Lett.2009 Jan 5;583:19-24.
- Micanovic R等人N-和C-末端在FGF21功能活性中的不同作用。J Cell Physiol.2009 May;219(2):227-34.
- Yusuke Murata等人FGF21作为脂质代谢的内分泌调节因子：从分子进化到生理学和病理生理学。营养与代谢杂志，2011年卷，文章ID 981315，8页
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