E.coli宿主细胞RNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中残留的E.coli总RNA含量的试剂盒。
本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理,可专一快速的检测E.coli细胞残留的总RNA,定量限低至1 fg/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)及Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)配套使用。
组分信息
组分编号
|
组分名称
|
41318ES50
|
41318ES60
|
41318-A
|
E.coli qPCR Mix
|
0.75 mL
|
1.5 mL
|
41318-B
|
One Step Enzyme Mix
|
200 μL
|
400 μL
|
41318-C
|
RNA Dilution Buffer
|
1.8 mL×2管
|
1.8 mL×4管
|
41318-D
|
E.coli RNA Control(20 ng/μL)
|
25 μL
|
50 μL
|
41318-E
|
IC*
|
50 μL
|
100 μL
|
*IC:Internal control,内部对照
运输和储存条件
1. 所有组分均干冰运输,-25~-15℃保存,有效期2年。其中,41318-A需避光保存。
2. 收到货后,请检查共5个组分是否齐全,并立即放入对应的保存温度中储存。
注意事项
1. 本产品仅作科研用途。
2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书,实验应规范操作,包括样本处理、反应体系的配制及加样。
4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀,低速离心。
适用机型
包含但不限于以下仪器:
Thermo Scientific:ABI 7500,ABI Quant Studio 5;
Bio-Rad:CFX96 Optic Module;
上海宏石医疗科技:SLAN-96S。
使用说明
1. E.coli RNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备
用试剂盒中提供的RNA Dilution Buffer(RNA稀释液)将E.coli RNA Control定量参考品进行梯度稀释*,稀释浓度依次为2 ng/μL、200 pg/μL、20 pg/μL、2 pg/μL、200 fg/μL、20 fg/μL、2 fg/μL。
具体操作如下:
1)将试剂盒中的E.coli RNA Control定量参考品和RNA Dilution Buffer置于冰上融化,待完全融化后,轻微振荡混匀,低速离心10 sec。
2)取7支洁净的1.5 mL离心管,分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6。
3)在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL RNA Dilution Buffer和10 μL E.coli RNA Control定量参考品,Std0即稀释为2 ng/μL的浓度,振荡混匀后低速离心10 sec,该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存(不超过3个月)**,使用时避免反复冻融。
4)在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5、Std6离心管中先分别加入90 μL RNA Dilution Buffer***,再进行梯度稀释****,具体稀释方法如下:
稀释管
|
稀释比例
|
终浓度
|
Std1
|
10 μL Std0 + 90 μL RNA Dilution Buffer
|
200 pg/μL
|
Std2
|
10 μL Std1 + 90 μL RNA Dilution Buffer
|
20 pg/μL
|
Std3
|
10 μL Std2 + 90 μL RNA Dilution Buffer
|
2 pg/μL
|
Std4
|
10 μL Std3 + 90 μL RNA Dilution Buffer
|
200 fg/μL
|
Std5
|
10 μL Std4 + 90 μL RNA Dilution Buffer
|
20 fg/μL
|
Std6
|
10 μL Std5 + 90 μL RNA Dilution Buffer
|
2 fg/μL
|
表1 标准品梯度稀释
*每个浓度做3个复孔,该试剂可测试200 pg/μL~2 fg/μL线性范围。若需要,可适当扩大或缩小线性范围。
**为减少反复冻融次数和避免污染,建议初次使用时将RNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。
***已融化未使用的RNA稀释液可保存于2-8℃ 7天,若长时间不用,请放置于-25~-15℃。
****为确保模板完全混匀,每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约15 sec。
2. 待测样本的前处理
1)样本中残留RNA的提取纯化可采用本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)。
2)待测样本在使用E.coli残留RNA试剂盒做qPCR检测前,需要进行DNase*处理,以消除gDNA对qPCR检测的影响。
3)DNase用量和消化条件需按实际样品优化,可咨询金畔生物获取相关建议。
*本试剂盒不含DNase试剂,推荐您购买本公司的Recombinant DNase I (RNase-free, Yeast) (Cat#14534ES50/14534ES60)。14534ES50规格50U的酶量对应E.coli残留RNA检测试剂盒41318ES50的50T规格的用量,同理14534ES60规格100U的酶量对应41318ES60的100T规格的用量。
3. 样本加标回收质控ERC的制备
根据需要设置ERC中的E.coli RNA标准品浓度(以制备加20 pg E.coli RNA量的ERC为例*),具体操作如下:
1)取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中,再加入10 μL Std3,混匀,标记为ERC。
2)加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理,制备加标回收ERC纯化液。
*一般建议样本加标量设置在样本中宿主细胞RNA实际残留量的0.8~1.5倍,如果样品中RNA残留量低于定量限,加标量应设置到定量限之内,以保证检测结果可靠。
4. 阴性抽提质控NCS的制备
根据实验设置阴性抽提质控NCS,具体操作如下:
1)取100 μL样本基质溶液(或RNA稀释液)加入1.5 mL洁净的离心管中,标记为NCS。
2)阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理,制备成阴性质控NCS纯化液。
5. 无模板对照NTC的制备
根据实验设置无模板对照NTC,具体操作如下:
1)无模板对照NTC无需进行样本前处理,在qPCR法检测残留RNA含量阶段开始配置即可。
2)每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液(15 μL E.coli qPCR Mix + 4 μL One Step Enzyme Mix + 1 μL IC)+ 10 μL RNA Dilution Buffer,建议配置3个重复孔的量。
6. 反应体系
组分
|
体积(μL)
|
E.coli qPCR Mix*
|
15
|
One Step Enzyme Mix
|
4
|
IC
|
1
|
RNA Template**
|
10
|
总体积***
|
30
|
表2 标准品反应体系
*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量:Mix混合液=(反应孔数+2)× (15+4+1) μL(含有2孔的损失量)。通常,每个样本做3个重复孔。
**反应孔数=(6个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数)× 3。
NTC (No Template Control):RNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution):样本基质溶液或RNA Dilution Buffer进行样本前处理后,所得纯化液为NCS
TS (Test Sample):待测样本
ERC (Extraction Recovery Control):待测样本中加入如10 μL的2 pg/μL标准品RNA后进行样本前处理,所得纯化液为加标回收ERC
***加样完成密封好管子后,请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,再震荡混匀5 sec以上,完全混匀反应液,再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底,如有气泡,需将气泡排尽。
下表为参考板位:
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
A
|
NTC
|
|
待测样本TS1
|
待测样本TS1
|
待测样本TS1
|
|
标准曲线Std1
|
标准曲线Std1
|
标准曲线Std1
|
|
|
|
B
|
NTC
|
|
待测样本TS2
|
待测样本TS2
|
待测样本TS2
|
|
标准曲线Std2
|
标准曲线Std2
|
标准曲线Std2
|
|
|
|
C
|
NTC
|
|
待测样本TS3
|
待测样本TS3
|
待测样本TS3
|
|
标准曲线Std3
|
标准曲线Std3
|
标准曲线Std3
|
|
|
|
D
|
|
|
|
|
|
|
标准曲线Std4
|
标准曲线Std4
|
标准曲线Std4
|
|
|
|
E
|
NCS
|
|
样本加标ERC1
|
样本加标ERC1
|
样本加标ERC1
|
|
标准曲线Std5
|
标准曲线Std5
|
标准曲线Std5
|
|
|
|
F
|
NCS
|
|
样本加标ERC2
|
样本加标ERC2
|
样本加标ERC2
|
|
标准曲线Std6
|
标准曲线Std6
|
标准曲线Std6
|
|
|
|
G
|
NCS
|
|
样本加标ERC3
|
样本加标ERC3
|
样本加标ERC3
|
|
|
|
|
|
|
|
H
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
表3 上机参考板位
该示例是对E.coli残留RNA qPCR法检测操作的展示,检测样本包括:6个浓度梯度的E.coli RNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。
7. 扩增程序参数设置(两步法)(以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例)
1)创建空白新程序,选择绝对定量检测模板。
2)创建2个检测探针,Target 1命名为“E.coli-RNA”,选择报告荧光基团为“FAM”,猝灭荧光基团为“None”;
Target 2命名为“IC”,选择报告荧光基团为“VIC”,猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为“ROX”(参比荧光可根据仪器型号等情况,选择是否需要添加)。
3)在“Assign target (s) to the selected wells”面板中,将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”,并且在“Quantity”一栏分别赋值为“200000”、“20000”、“2000”、“200”、“20”、“2”(含义为每孔RNA浓度,单位为fg/μL),并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“200 pg/μL”、“20 pg/μL”、“2 pg/μL”、“200 fg/μL”、“20 fg/μL”、“2 fg/μL”;将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”;将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”,并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”,参比荧光勾选“ROX”,之后点击“Start Run”,开始仪器运行。
4)扩增程序设置:设置三步法扩增程序,反应体积30 μL。
循环步骤
|
温度(℃)
|
时间
|
循环数
|
逆转录
|
50℃
|
20 min
|
1
|
预变性
|
95℃
|
5 min
|
1
|
变性
|
95℃
|
15 sec
|
40
|
退火/延伸(收集荧光)
|
60℃
|
30 sec
|
表4 扩增程序
8. qPCR结果分析
1)在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中,系统会自动给出“Threshold”,有时系统给出的“Threshold”离基线太近,导致复孔之间Ct相差甚远,可手动调节“Threshold”至合适位置,点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2)在“Analysis”的“Standard Curve”面板中,可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲:R²>0.99,扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内,Slope在-3.6~-3.1。
3)在“Analysis”的“View well table”面板中,“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值,单位为fg/μL,后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。
4)结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本,一般也可由仪器自动判读。
5)根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率,加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式:回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL)-样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / RNA加入量理论值(eg.pg)×100%。
6)阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。
7)无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥32。
8)待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1,如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大,则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本,则优先考虑样本加标回收率结果,IC结果作为参考。
Ver.CN20230830