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Nvigen K61003-快速提取cfDNA专业技术

发表于由

说起肿瘤、癌症，已经不再像多年前一样让谈癌色变，但仍旧为人们所恐惧。成功治疗肿瘤还是以早发现早治疗为主。那么尽早检测和发现肿瘤便是*的核心。液体活检(Liquid biopsy)的检测方法，可以捕获到进入血液的其它细胞或DNA，从而替代了疾病的诊断，例如肿瘤。近比较火热的液体活检有：cfDNA（Circulating cell-free DNA）、CTC和外泌体的检测。

 

 

对于CTC和外泌体的信息，我们已发表过2篇文章描述，欲知详情，请浏览：

 

 

游离循环DNA（cfDNA）存在于血液，包含双链DN**段，绝大多数是短链，而且通常浓度很低。在健康人体中，血浆cfDNA被认为来自于正常的造血细胞。cfDNA的循环半衰期很短，这提示它需要在细胞凋亡时被持续的释放。在特定的生理条件或疾病过程中，有相当一部分cfDNA会与在健康的时候不同，基于这一结果，近年来cfDNA已被用于无创性诊断。在孕妇中，约有10%-15%的cfDNA来自于胎盘滋养层，现在cfDNA多用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷，这就是是当前火热的无创唐氏筛查的基础！在肿瘤病人中，通过cfDNA的量化突变来检测肿瘤已被越来越多的人认可。而在移植方面，移植排斥反应也与供体移植器官中的cfDNA水平相关。

 

Figure.2 血液中的复杂组分

而循环肿瘤DNA（ctDNA）是来源于肿瘤细胞的cfDNA，属于cfDNA的一种类型。两者为包含关系，ctDNA仅为cfDNA很小的一部分。ctDNA来自肿瘤细胞的体细胞突变，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞。往往在提到循环肿瘤DNA的时候，大家往往简单的将它认为是肿瘤患者外周血中游离的DNA。其实不然，虽然ctDNA所占cfDNA的比例波动范围非常大，约0.01％～90％，但实际上，大多数ctDNA在cfDNA中的占比约为0.2%。

 

如何有效分离提取cfDNA(ctDNA)用于检测，已成为科研工作者必须突破的问题！

 

 

Nvigen是一种纳米技术，支持个性化医疗创新。

Nanopsy™是由先进的分子工程纳米粒子Magvigen™和Myquvigen™实现的，能够有效地从蛋白质、细胞和核酸中捕获和识别分子信息。我们正在将nanopsy™开发成可在成百上千家医院部署的、自动化和FDA批准的临床仪器和试剂盒，将致命的癌症转变为可控制的疾病。

用链霉亲和素珠和生物素探针捕获DNA
Magvigen™、Myquvigen™和Maxvigen™纳米颗粒是多功能和可生物降解的磁性和/或荧光磁性纳米颗粒，在加利福尼亚大学、伯克利大学、斯坦福大学和NVIGEN经过18年的严格研究和开发后达到。

上海金畔生物Nvigen K61003-快速提取cfDNA专业技术

捕获血浆中cfDNA的磁珠

 

 

产品名称 应用 目录号 规格/价格(1ml, USD)
MagVigen™ – Plasma DNA Capture Kit 对血浆中的 cfDNA 的捕获 
 		 K61003

Sizes (Plasma)
100 ml $499.00

1,000 ml $3,999.00

 

 

产品介绍: MagVigen™ Plasma DNA Capture 磁性纳米颗粒专为捕获血液中的cfDNA而设计，为科研， 分子检测工作者提供了一种简单、快速、的血液cfDNA提取方法。整个实验过程中无需离心或者过柱。DNA提取可以线性比例扩大，输入血浆范围为100 uL至10mL 。分离出的cfDNA 可以用Agilent Bioanalyzer 直接定量分析。

下游应用: PCR, DNA测序，二代测序技术(NGS), 以及测序文库构建。

产品特点:

  • 高产量
  • 高质量DNA提取
  • 工作流程简单
  • 血浆体积可线性扩展
  • 质量稳定，提取结果高度一致

实验例子:

Figure 1. cfDNA extraction yield and size from 1.5 ml plasma samples with (blue) and without (red) spiking in DNA. Calculated yield of spiking in DNA by subtraction of endogenous cfDNA from total DNA were 80% using picogreen assay and 91% with bioanalyzer quantification.

Figure 2. cfDNA extracted from 100 µl to 5 ml of plasma was quantified by pico-green analysis.

Figure 3. cfDNA extraction yield was quantified by pico-green analysis following DNA isolation with the MagVigen™ Plasma DNA Capture Kit and kit C.

Figure 4. Beta-globin level and GAPDH levels were estimated by PCR analysis.

 

 

 

血清/血浆游离 DNA（cfDNA） 提取试剂盒

发表于由

cfPure™血清/血浆游离  DNA（cfDNA） 提取试剂盒

（磁珠法）

 

目录号：K5011610, K5011625

 

产品内容

产品号：K5011610（100ml 血清/血浆样本提取试剂盒）

组分

产品号

规格

1.  裂解/结合液 Lysis/Binding Buffer

K5011610-1

1 x 115 ml

2.  洗涤液 Wash Buffer

K5011610-2

2 x 55 ml

3.  洗脱液 Elution Buffer

K5011610-3

1 x 6 ml

4.  磁珠溶液 Magnetic Bead Solution

K5011610-4

2 x 1.33 ml

产品号：K5011625（250ml 血清/血浆样本提取试剂盒）

组分

产品号

规格

1.  裂解/结合液 Lysis/Binding Buffer

K5011625-1

3 x 95 ml

2.  洗涤液 Wash Buffer

K5011625-2

5 x 55 ml

3.  洗脱液 Elution Buffer

K5011625-3

1 x 15 ml

4.  磁珠溶液 Magnetic Bead Solution

K5011625-4

5 x 1.33 ml

 

储存条件

该试剂盒置于室温（15-25℃）干燥条件下，可保存 12 个月。

特点

l 无毒。

l 高回收率。

l 操作灵活的实验程序。

l 纯化的 DNA 可用于二代测序(NGS), 荧光定量 PCR 和亚硫酸氢盐测序等。

产品简介

本试剂盒可率从血清/血浆中提取游离 DNA，磁珠法程序适用于多种核酸自动化提取 仪，所得游离 DNA 可直接用于 PCR 模  板、qPCR、二代测序（NGS）和其他应用程序。 规格

100ml 血清/血浆样本提取试剂盒

250ml 血清/血浆样本提取试剂盒 质量控制 所有试剂均经过纯度和有效性测试。

注意事项 请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项

样本：新鲜和冻存血清/血浆均可使用，新鲜样本会有较高的得率。

量化：每毫升血清/血浆游离 DNA 得率为 1-100 微克。用分光光度法定量（例如. Nanodrop）

可能无法准确地测定得率。可使用 Qubit™  dsDNA High Sensitivity Assay。

聚合酶链反应(PCR)的建议：由于血清/血浆中提取 DNA 多数为小片段特性，设计引物时需谨

慎。游离 DNA 往往为小片段 170bp 左右，因此，PCR 引物设计应该生成的产物为小于 150 bp

范围。健康人血浆游离 DNA 浓度低，PCR 的循环次数在某些情况下需达到 40 个循环。

treck Cell-Free DNA BCT Tube(s) 基因检测无创采血管:  无创管经蛋白酶 K 处理可分离高质

量的无细胞 DNA，否则 DNA 得率会减少 50%。

自备设备和试剂

l     移液管

l     涡流混合器

l     磁力架

l     1.5 ml 不黏离心管

l     无水乙醇

使用前：裂解/结合液 Lysis/Binding Buffer 及 Wash Buffer 洗涤液为浓缩液。若溶液发生 沉淀，放置 37°C 水浴中预热 30 分钟，以溶解沉淀。*次使用试剂盒时，请按照提示在裂 解/结合液 Lysis/Binding Buffer 及洗涤液 Wash Buffer 加入无水乙醇，储存 2–8°C 有效期一年， 盖紧瓶盖以确保长期存储。

产品号：K5011610

l    加入 23ml 无水乙醇至裂解/结合液 Lysis/Binding Buffer 中，轻轻颠倒混匀。

l     加入 51 ml 无水乙醇至每个洗涤液 Wash Buffer 中，轻轻颠倒混匀。

l     每次提取前配制新鲜 80%乙醇。

产品号：K5011625

l    加入 19ml 无水乙醇至每个裂解/结合液 Lysis/Binding Buffer 中，轻轻颠倒混匀。

l 加入 51 ml 无水乙醇至每个洗涤液 Wash Buffer 中，轻轻颠倒混匀。

l 每次提取前配制新鲜 80%乙醇。

实验前确定要提取的血清/血浆量（100µl~10ml  均可），按下表计算所需裂解/结合液

Lysis/Binding Buffer 和 Magnetic Bead Solution 磁珠溶液使用量。

 

血清/血浆

裂解/结合液

 

Lysis/Binding Buffer

磁珠溶液 Magnetic

 

Bead Solution

离心管尺寸

x (x=ml of 血清/血浆)

1.25x

0.025x

N/A

500 µl

750 µl

12.5 µl

2 ml

1 ml

1.25 ml

25 µl

15 ml

5 ml

6.25 ml

125 µl

15 ml or 或 50ml*

10 ml

12.50 ml

250 µl

50 ml

 

*5ml 或以上血清/血浆建议使用 50ml 离心管，使用 15ml 离心管造成泄露会造成得率降低。

蛋白酶 K 处理

如果样品使用基因检测无创采血管 Streck Cell-Free DNA BCT Tube(s)采集，蛋白酶 K 处理可

确保高回收率。非该采血管采集的样本可直接进行裂解/结合 Lysis/Binding 步骤。

 

血清/血浆

蛋白酶 K

20% SDS 溶液

x (x=ml of 血清/血浆)

0.015 x

0.050 x

500 µl

7.5 µl

25 µl

1 ml

15 µl

50 µl

5 ml

75 µl

250 µl

10 ml

150 µl

500 µl

 

1. 加入适量血清/血浆到适合的离心管中。

2. 每 1ml 血清/血浆加入 15 µl 蛋白酶 K（20 mg/ml）。

3. 每 1ml 血清/血浆加入 50 µl SDS（20%）溶液。

4. 颠倒混匀 5 次。

5. 60°C 孵育 20 分钟。

6. 冰上预冷 5 分钟，放置室温。

7. 放置室温后可进行裂解/结合 Lysis/Binding 第二步

裂解/结合 Lysis/Binding

1. 加入适量血清/血浆到适合离心管中。

2. 每 1ml 血清/血浆加入 1.25ml 裂解/结合液 Lysis/Binding Buffer。

3. 每 1ml 血清/血浆加入 25µl 磁珠溶液 Magnetic Bead Solution。 注意：加入之前混匀磁珠溶液，确保溶液无磁珠沉淀。磁珠会迅速下沉所以每次加样前都 要混匀磁珠，以免造成 DNA 得率不一致。

4. 室温涡流混合或用力摇动离心管 10 分钟。*为获得高产量，确保血样本/缓冲溶液在管内混 合，推荐使用旋涡混合器。

5. 将离心管置于磁力架磁分离 2~5 分钟或直至溶液清透。

6. 保持离心管置于磁力架上小心去除上清，不要触碰磁珠。

7. 保持离心管置于磁力架上 1 分钟，去除残液。

*次洗涤

8. 加入 1000µl 洗涤液 Wash Buffer 至第 7 步裂解/结合 Lysis/Binding 管中。 9. 涡流混合 10 秒或移液管吹打 6 次重悬磁珠。

10.  将重悬液移至 1.5ml 离心管置于磁力架。

11.  置于磁力架 10~30 秒。

12.  移液管抽取上清至裂解/结合 Lysis/Bindin 管。

13. 将裂解/结合 Lysis/Bindin 管中剩余磁珠全部移至 1.5ml 离心管。

14.  1.5ml 离心管置于磁力架磁分离 10~30 秒至液体清澈。

15.  用 1000µl 移液枪头尽量去除上清。

16. 用装有离心管的磁力架轻轻敲击实验台 5 次，用 200µl 移液枪头去除废液。

17.  离心管移至试管架上加入 1000µl 洗涤液 Wash Buffer。

18.  涡流混合 20 秒或移液管吹打 6 次重悬磁珠。

19.  短暂离心。*离心仅用于涡流混合之重悬磁珠，短暂离心仅为去除离心管盖上的吸附液体。

20.  离心管置于磁力架磁分离 10~30 秒。

21.  用 1000µl 移液枪头尽量去除上清。

22. 用装有离心管的磁力架轻轻敲击实验台 5 次，用 200µl 移液枪头去除废液。

第二次洗涤

23.  离心管移至试管架上加入 1000µl 乙醇（80%）。

24.  涡流混合 20 秒或移液管吹打 6 次重悬磁珠。

25. 短暂离心。

26.  离心管置于磁力架磁分离 10~30 秒至溶液清澈。

27.  用 1000µl 移液枪头尽量去除上清。

28. 用装有离心管的磁力架轻轻敲击实验台 5 次，用 200µl 移液枪头去除废液。

29.  离心管移至试管架上加入 1000µl 乙醇（80%）。

30. 涡流混合 20 秒或移液管吹打 6 次重悬磁珠。

31. 短暂离心。

32.  离心管置于磁力架磁分离 10~20 秒。

33.  用 1000µl 移液枪头尽量去除上清并保持管盖打开。

34.  用装有离心管的磁力架轻轻敲击实验台 5 次。

35.  用 200µl 移液枪头去除废液。

36. 保持管盖打开 2 分钟，磁力架轻轻敲击实验台 5 次，用 200µl 移液枪头去除废液。

37.  继续干燥 1-3 分钟。*注意不要过分干燥以免磁珠粘在管壁上。

洗脱

38.  离心管移至试管架上加入适量洗脱液 Elution Buffer。注意：建议每毫升血清/血浆加入 12.5

µl 洗脱液 Elution Buffer 以确保*得率。 39.  涡流混合或用力摇动离心管 5 分钟。

40. 短暂离心。

41.  置于磁力架 10~30 秒。

42.  上清移至新 1.5ml 离心管。