产品简介

 

CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒适用于定量检测来源于HIV-1型慢病毒载体技术制备的人源细胞产品，如CAR-T或TCR-T细胞基因组中CAR或TCR基因的拷贝数。

CAR/TCR基因拷贝数检测试剂盒基于荧光探针定量PCR原理，采用多重qPCR方法分别检测转移质粒上与整合或表达功能相关的DNA序列和人体细胞中单拷贝基因(Single Copy Gene, SCG)的方法，计算得到样本中平均每个细胞的目的基因拷贝数，如CAR或TCR基因拷贝数水平。其定量限可以达到10¹ copies/μL水平。该试剂盒需要与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

产品信息

 

货号	41313ES50 / 41313ES60
规格	50 T / 100 T

 

组分信息

 

组分编号	组分名称	41313ES50	41313ES60
41313-A	CAR/TCR qPCR Mix	0.75 mL	1.5 mL
41313-B	CAR/TCR Primer&probe Mix	200 μL	400 μL
41313-C	DNA Dilution Buffer	2×1.8 mL	4×1.8mL
41313-D	CAR/TCR DNA Control (2.1×108 copies/μL)	25 μL	50 μL
41313-E	IC*	50 μL	100 μL

^*IC：Internal control，内部对照。

 

运输和储存条件

 

1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。且41313-A和41313-B均需避光保存。

2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

适用机型

 

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

 

使用说明

 

1. CAR/TCR DNA定量参考品的稀释和标准曲线的制备

CAR/TCR DNA定量参考品是同时含有CAR/TCR目的基因序列和SCG目的基因序列的质粒DNA，所以试剂盒的CAR/TCR DNA Control组分里，CAR/TCR和SCG的基因拷贝数是一样的。

用试剂盒中的DNA Dilution Buffer（DNA稀释液）将CAR/TCR DNA Control定量参考品进行梯度稀释^*，稀释浓度依次为2.1×10⁶ copies/μL、2.1×10⁵ copies/μL、2.1×10⁴ copies/μL、2.1×10³ copies/μL、2.1×10² copies/μL。操作如下：

1）将试剂盒中CAR/TCR DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室温融化，然后轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2）取6支干净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）在标记Std0的1.5 mL管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL CAR/TCR DNA Control，即稀释为2.1×10⁷ copies/μL，振荡混匀后短暂快速离心10 sec，该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过6个月）^**，使用时避免反复冻融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer^***，再进行梯度稀释^****，稀释方法如下：

稀释管	稀释比例	终浓度
		CAR/TCR (copies/μL)	SCG (copies/μL)
Std1	10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×106	2.1×106
Std2	10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×105	2.1×105
Std3	10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×104	2.1×104
Std4	10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×103	2.1×103
Std5	10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer	2.1×102	2.1×102

表1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试2.1×10⁶ copies/μL~2.1×10² copies/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

***已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2~8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。

****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中CAR/TCR DNA标准品浓度（以制备加2.1×10⁴ copies CAR/TCR DNA量的ERC为例），具体操作：

1） 取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std4，混匀，标记为ERC。

2） 加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1） 取100 μL样本基质溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2） 阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1） 无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测CAR/TCR DNA含量阶段开始配置即可。

2） 每管或孔中的NTC反应体系为20 μL Mix混合液（即15 μL CAR/TCR qPCR Mix + 4μL CAR/TCR Primer&Probe Mix+ 1μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

5. 反应体系

反应体系	体系（μL）
CAR/TCR qPCR Mix*	15
CAR/TCR Primer&probe Mix	4
IC	1
DNA template**	10
总体积***	30

表2 标准品反应体系

^*根据反应孔数计算本次所需的Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）×(15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

^**反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）×3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如2.1×10⁴ copies标准品DNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

^***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下图为参考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

B

NTC

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

C

NTC

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

D

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

E

NCS

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

F

NCS

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

G

NCS

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

H

表3 上机参考板位

该示例是对CAR/TCR基因拷贝数的qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度的CAR/TCR DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个样本加标回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2）创建2个检测探针，第一个命名为“CAR/TCR-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；第二个命名为“SCG，选择报告荧光基团为“VIC”，猝灭荧光基团为“None”；再创建1个检测探针，命名为“IC”，选择报告荧光基团为“CY5”，猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加；若选择ROX校准，建议阈值线选择0.06）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“2100000”、“210000”、“21000”、“2100”、“210”（含义为每孔的DNA浓度，单位为copies/μL），并且在相应的“sample name”一栏中命名为“2100000 copies/μL”、“210000 copies/μL”、“21000 copies/μL”、“2100 copies/μL”、“210 copies/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4）扩增程序设置：设置反应体积30 μL。

循环步骤	温度（℃）	时间	循环数
污染消化	37℃	5 min	1
预变性	95℃	5 min	1
变性	95℃	15 sec	45
退火/延伸（收集荧光）	60℃	30 sec

表4 扩增程序

 

7. qPCR 结果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲：R²>0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为copies/μL，后续可在检测报告中进行单位换算。

4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5）根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.copies/µL)-样本测定值(eg.copies/µL)} x洗脱体积(µL) / DNA加入量理论值(eg.copies) x 100%。

6）阴性质控NCS的Ct值应为Undetermined或Ct值≥35。

7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥38。

8）每个细胞中的CAR或TCR拷贝数=

 

注意事项

 

1. 使用本试剂前请仔细阅读本说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

2. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅作科研用途。

 

Ver.CN20231227

Q：标准品是线性化的质粒还是环状质粒？

A：线性化的

Q：可以使用用LightCycler2.0检测吗？

A：不可以，因为这个仪器不具备CY5通道