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使用AmpliScribe™高产量转录试剂盒可

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使用AmpliScribe™高产量转录试剂盒可
能zui高产量的持续制备RNA

Judith T. Schanke, EPICENTRE Technologies

介绍：
      使用嗜菌体RNA多聚酶体外转录DNA模板是普遍使用的产生特异RNA转录本的有效方法。嗜菌体RNA多聚酶从特异的嗜菌体启动子控制下的克隆的线性DNA模板合成RNA。体外转录产生的RNA广泛地用于包括体外翻译，核酶合成1，剪切及加工研究，结构鉴定以及制备非放射性RNA探针2-4。通过转录反应产生的RNA转录本还可以以显微注射的方式导入细胞5进行反应实验，或用于RNA的细胞定位4。
      EPICETRE公司的AmpliScribeäT7，T3和SP6高产量转录试剂盒使用高浓度的NTPs（抑制其它试剂盒和其它传统转录系统），能zui大可能地产生大小范围从25碱基到数千碱基的RNA转录本6。使用AmpliScribeT7RNA转录反应可以从每微克DNA模板产生多至150微克的高质量，全长（1.4kb）的RNA转录本。在此，从体外转录产品的产量或及RNA的完整性两方面，将AmpliScribeT7转录试剂盒与传统的T7RNA多聚酶转录反应体系7及另两个供应商的类似试剂盒相比较。
 

材料与方法：

  • DNA模板的制备
        线性DNA模板以限制性内切酶酶切质粒DNA产生。消化后的DNA以200µg/ml蛋白酶K和0.5%SDS，50°C处理30分钟zui大限度地减少核酸酶污染。酚/氯仿法抽提后乙醇沉淀纯化质粒，再以TE重悬。AmpliScribe线性对照DNA由试剂盒提供。
  • 转录反应
        AmpliScribeT7转录反应按试剂盒提供的方法进行。20µl反应体系中含1×反应缓冲液，10mM DTT，7.5mM NTPs，1µg线性DNA模板，2µl AmpliScribeT7酶溶液，37°C反应2小时。用其它厂商试剂盒进行转录反应时按试剂盒提供的方法进行。每20µl反应体系中含1µg线性DNA模板，37°C反应2小时。传统的转录反应体系含10UT7 RNA多聚酶，0.5mM NTPs，1×转录缓冲液及10mM DTT7。
  • RNA定量和完整性分析
        加入等体积冷5M醋酸铵终止转录反应，样品冰上放置10分钟，zui大速度离心10分钟沉淀RNA。光谱测定法定量，使用标准方法进行非变性琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。

结果与讨论：
      与传统方法相比，AmpliScribe高产量转录试剂盒能产生20倍以上的RNA。使用AmpliScribeT7高产量转录试剂盒和传统T7RNA多聚酶反应定时转录以制备1.4kb的转录本。37°C反应2小时，醋酸铵沉淀法终止反应。光谱分析测定RNA产量。使用AmpliScribeT7转录反应可以较传统反应多产生20被以上的全长RNA转录本。

  • AmpliScribeT7高产量转录试剂盒持续地产生zui大产量的RNA。
        比较AmpliScribeT7高产量转录试剂盒和另两个供应商的高产量试剂盒以生产商推荐的方法对从63碱基到2.6kb长度的三个线性DNA模板进行转录反应2小时。AmpliScribeT7试剂盒较另两个高产量试剂盒持续产生更多的转录本。
  • AmpliScribeT7高产量转录试剂盒有更高的短RNA（<300碱基）产生
        产生大量的短RNA转录本较标准模板要有更多的起始事件。使用AmpliScribeT7高产量转录试剂盒能较另两个供应商A和P的试剂盒产生更多的短转录本。供应商A的T7转录试剂盒也是特为产生短RNA（<300碱基）的。为了与此“段转录”试剂盒进行比较，进行了比较反应。
     

    结果表明AmpliScribe试剂盒能较供应商A的短模板转录试剂盒产生更多的63碱基转录本。以标准2小时反应，AmpliScribe转录反应产生的RNA是其它系统的两倍、延长反应时间至6小时，产生的RNA量则为供应商A的试剂盒产量的4倍之多。尽管产生的段RNA微克数较1kb以上的RNA量少，但短RNA的分子数则大于1kb以上的RNA。反应6小时后可以观察到A供应商的试剂盒产生的RNA有降解现象，而AmpliScribe试剂盒可以持续增加全长RNA转录本。

  • AmpliScribeT7高产量转录试剂盒产生完整性好的RNA
        理想的体外转录反应应该产生全长的完整RNA转录本。为了比较产生的RNA转录本的完整性，AmpliScribeT7试剂盒与另两个供应商A和P的高产量试剂盒产生的转录产物进行了琼脂糖凝胶电泳分析。所有被测的试剂盒均产生高质量，全长的1.8kbRNA转录产物。在时间曲线实验中，AmpliScribeT7试剂盒产生的1.4kb转录本的完整性在2，4，6小时时间点上进行检测，证明在所有时间点均产生高质量的全长RNA。

总结：
    AmpliScribeT7高产量转录试剂盒持续性产生的RNA产量可能是当前已有体外转录系统中产量zui高的。它能地以广域的DNA为模板，重复性合成大量的全长RNA。

参考文献：
1. Hoffman, L. and Johnson, M. （1994） BioTechniques 17, 372.
2. 1995 Epicentre Forum 2（5）, 4.
3. Kaplan, E. D., et al. （1996） Epicentre Forum 3（2）, 1.
4. Pederson, T. （1999） EASEBJ Suppl. 2, S238.
5. De Wit, T. et al. （1998） Nucl. Acids Res. 26（2）, 676.
6. 1996 Epicentre Forum 3（1）, 6.
7. Melton, D. Et al. （1984） Nucl. Acids Res. 12, 7035.