世界*实验材料供应商 Agilent Technologies 上海金畔生物为其中国代理， Agilent Technologies 在一直是行业的*,一直为广大科研客户提供zui为的产品和服务,上海金畔生物一直秉承为中国科研客户带来的产品，的服务， Agilent Technologies 就是为了给广大科研客户带来更加完善的产品和服务,您的满意将是我们zui大的收获

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Agilent Technologies是生命科学，诊断和应用化学品市场的。该公司为世界各地的实验室提供仪器，服务，消耗品，应用和专业知识，使客户能够获得他们所寻求的见解。安捷伦的专业知识和值得信赖的合作使他们对我们的解决方案具有zui高的信

安捷伦专注于六个关键市场，我们帮助客户实现其目标：

食品：安捷伦帮助确保我们的食品供应不受污染，无论是化学，病毒，细菌或微生物。我们的客户包括控制食品安全的政府监管机构和实验室，以及向公众生产，包装和销售食品的私营公司。

环境和法证：从农药到药物残留物到痕量金属，我们提供快速，准确和敏感的方法来监测影响生活质量的污染物。安捷伦解决方案在执法方面也发挥重要作用，提供强大的工具和工具来分析和验证审判证据，并保持世界*运动员的诚实。

制药：安捷伦是任何为制药行业服务的公司的zui广泛的解决方案之一。我们的解决方案为制药行业的各个领域提供准确的答案，从疾病研究和药物开发到药物开发，制造和质量控制。从始至终的解决方案集意味着客户可以更快地将产品推向市场。客户信任我们帮助他们测试其治疗的纯度。安捷伦还确保其仪器和过程符合zui高合规法规。

诊断：安捷伦医生在打击癌症和其他疾病方面成为*。我们的解决方案帮助病理实验室向他们服务的医生，医院和医疗中心提供快速，准确的信息。我们帮助医疗专业人员做出更准确的诊断，使患者能够获得zui有效的治疗方法。

化学能源：世界经济能源，能源公司需要，地定位，提取和精炼燃料。我们的解决方案可帮助客户zui大化生产，并在炼油厂发生前预测其故障。安捷伦还帮助能源研究人员调查生物燃料，可再生燃料和其他形式的替代能源。

研究：大多数生命科学和诊断研究都是在*大学完成的，得到了​​各国政府的资助。安捷伦正在帮助这些研究人员了解更多关于癌症，心血管疾病，糖尿病，阿尔茨海默病，帕金森病，孤独症等疾病。我们的仪器，软件和样品制备解决方案可帮助科学家进行更快，更准确的研究。

XL1-Blue电穿孔细胞

克隆非甲基化DNA，≥1×10 10转化子/μg

货号：200228

规格：5×0.1mL

一般克隆

XL1-Blue菌株是一种的细胞系，是常规克隆需要的理想选择。XL1-Blue菌株被设计为提供用于质粒和λ噬菌体载体的*繁殖的宿主。它们允许进行蓝白色筛选，单链拯救噬菌粒DNA和制备高质量的质粒DNA。该菌株具有多种转化效率，包括作为衍生物的XL2-Blue，以及化学或电穿孔的版本。

agilent 210518说明书

agilent 210518即Stratagene 210518

QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit

Instruction Manual Catalog # 210518 (10 reactions) and #210519 (30 reactions) Revision F.0

uikchange闪电现场定向诱变试剂盒

Quikchange闪电现场定向诱变试剂盒
提供的材料

Quikchange Lightning Site定向诱变试剂盒（目录210518）含有足够的试剂，总共10种。
反应，包括2个控制反应。
b Quikchange Lightning Site定向诱变试剂盒（目录210519）含有足够30种试剂。
反应，包括2个控制反应。
c将dntp混合物解冻一次，制备一次性小份，并将小份储存在-20°C下。不要对dntp混合物进行处理。
多次冻融循环。d dntp混合物和dpn i酶的成分是专有的。这些试剂已针对
quikchange-lightning协议，并已获得与其他套件组件一起使用的资格。不
用其他安捷伦试剂盒或其他来源的dntp混合物或dpn i酶制剂替代。
E基因型：tetr
∆（mcra）183∆（mcrcb hsdsmr mrr）173 enda1 supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac hte
【F’Proab Laci】
Q
Z∆M15 tn10（太特
Amy Camr
]
f见介质和试剂的制备。
储存条件
XL10金超能干细胞、XL10金β-Me和PUC18控制质粒：–80°C
所有其他部件：–20°C
所需附加材料
14毫升bd falcon聚丙烯圆底管（bd biosciences目录）
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal）
异丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG）

买方通知
本产品的使用是根据以下美国专有技术号57891665932419中的一个或多个获得许可的，
6391548、6713285、7132265和7176004。
本产品是根据Bio-Rad实验室和安捷伦技术公司之间的协议提供的。
本产品的制造、使用、销售或进口均以我方为准。拍打。编号6627424和EP
拍打。Bio-Rad Laboratories，Inc.所有的1 283 875 B1号。购买本产品后将
买方不可转让使用购买的产品和部件的权利。
研究领域的PCR产品（但不是实时PCR），包括所有应用研究领域
（包括但不限于动物试验和食品试验）。

介绍
Quikchange Lightning站点定向诱变套件*提供突变
质粒比我们原来的QuikChange试剂盒快三倍
诱变效率或准确性的损失。该套件已针对
高达14kb质粒的诱变，允许快速、和
用单一试剂盒诱变大小质粒。使用
先进的高保真酶技术，协议
加速，同时保持高的现场指导精度
诱变。QuikChange Lightning网站
诱变试剂盒是一种专有技术的基于pfu的聚合酶混合物。
优化的dpn i酶，它们一起允许在
大约一个小时，加上一夜之间的转变。

图1 Quikchange闪电现场定向诱变方法概述。

美国专有技术号7176004；7132265；6734293；6444428；6391548；6183997；
5948663、5932419和5789166。
六
体外定向诱变是一种非常有价值的技术
描述蛋白质结构之间的动态、复杂关系
和功能，用于研究基因表达元件，以及执行
矢量修改。这种技术的几种方法
但这些方法通常需要单链DNA
（SSDNA）作为模板1–4
劳动密集型或技术难度大。
我们的QuikChange Lightning站点定向诱变套件允许站点特定
几乎所有双链质粒的突变，从而消除
亚克隆和SSDNA救援的需求。5
此外，QuikChange
闪电现场定向诱变试剂盒不需要专门的
载体，*的限制位点，多重转化或体外
甲基化处理步骤。简单、快速的三步程序需要
仅在转化前1小时（对于小于等于5 kb的质粒），以及
在单一反应中产生效率大于85%的突变体（参见
图1）。
Quikchange闪电酶是一种新型的专有技术混合物
包括pfuultra高保真（hf）DNA聚合酶**的衍生物
两条质粒链的诱变引物定向复制
高保真度。所有的基本程序都采用了超螺旋双绞线。
一个感兴趣的插入物和两个合成物的DNA（dsdna）载体
寡核苷酸引物，均含有所需的突变（见图1）。
寡核苷酸引物，每个引物与
载体，在温度循环过程中被pfuultra-hf-dna扩展。
聚合酶，无底物置换。寡核苷酸的延伸
引物产生含有交错缺口的突变质粒。跟随
温度循环，产品经DPN I处理。
内切酶（靶序列：5´-GM6ATC-3´）对甲基化有特异性。
半甲基化DNA，用于消化亲本DNA模板
并选择含有合成DNA的突变。6（DNA分离
几乎所有的大肠杆菌菌株都是DAM甲基化的，因此对
含有所需突变的刻痕载体DNA。
然后转化为XL10金超能力细胞。
注意，质粒DNA从几乎所有常用的
大肠杆菌菌株（DAM+）是甲基化的，是
突变，质粒DNA从特殊的DAM中分离出来-
包括JM110和SCS110在内的大肠杆菌菌株不适用。
不需要的第二位点错误几乎被消除，高突变
由于该方法的高保真度，
pfuultra-hf-dna聚合酶，使用少量起始dna
模板和使用的热循环次数少。
QuikChange Lightning Site定向诱变试剂盒可用于
点突变，替换氨基酸，删除或插入单个或
多种相邻氨基酸。该试剂盒已用质粒进行了优化。
大小从4到14 KB不等。

* NOS的美国专有技术。6734293 6444428 6183997和5948663；；；。DNA聚合酶有HF会pfuultra 18倍比Taq DNA合成的高逼真度
DNA聚合酶。
7
控制quikchange闪电诱变
在pwhitescript 4.5-kb控制质粒是用来测试的效率
代突变质粒使用网站定向quikchange闪电
诱变试剂盒。在pwhitescript 4.5-kb质粒包含停止控制
密码子TAA密码子谷氨酰胺在位置（CAA）的其中一个
通常出现在β-半乳糖苷酶基因的质粒pBluescript II SK（-）
噬菌粒（9相应到氨基酸的蛋白质）。xl10金
ultracompetent细胞转化质粒与本控制上出现白色
lb–ampicillin琼脂板（湖的制备和研究——媒体）
含有IPTG和X-gal，因为β-半乳糖苷酶的活动。
obliterated。创建一个寡核苷酸控制点突变在primers
一个reverts pwhitescript 4.5-kb控制质粒的T残留的停止
在密码子的氨基酸（TAA）的β-半乳糖苷酶基因的9个残基的C，
生产的谷氨酰胺密码子（CAA）发现野生型序列。
以下screened殖民地可以转化为β-半乳糖苷酶
（β-半乳糖+）表型的媒体上的蓝色的颜色含有IPTG和X-gal染色。

底漆设计指南
本方案中使用的致突变寡核苷酸引物必须是
根据所需的突变单独设计。以下
设计诱变引物时应考虑：
♦两个诱变引物都必须包含所需的诱变和
在质粒的相反链上退火到相同的序列。
♦底漆的长度应在25至45个底座之间，并熔化。
温度（tm）≥78°C。可使用长度超过45个碱基的底漆，
但使用较长的引物会增加二次结构的可能性。
从而影响诱变反应的效率。
下列公式通常用于估算
引物：Tm = 81.5 + 0.41(%GC) − (675/N) − % mismatch
计算tm时：

•n是底材中的底漆长度
•%gc和%mismatch的值是整数
用于计算用于引入插入或
删除，使用上述公式的修改版本：
81.5+0.41%（gc）（675/）tm=−n
其中n不包括插入或删除的基

所需的突变（缺失或插入）应在
底漆两边各有大约10-15个正确顺序的底座。
♦底漆的低GC含量应为40%，并且
应以一个或多个C或G基终止。
♦引物不需要5´磷酸化。
tm=81.5+0.41%（gc）−（675/n）−不匹配百分比
九
♦对于典型的诱变引物，脱盐纯化通常是
足够的。对于长的或复杂的诱变引物，纯化
液相色谱法（PLAC/FPLC）或聚丙烯酰胺凝胶
电泳（PAGE）可显著增加
诱变效率。
其他底漆注意事项
♦诱变方案使用每个寡核苷酸引物125 ng。
要将纳克转化为低聚物的皮摩尔，请使用以下方法
方程式：

保持底漆浓度过高很重要。我们建议
改变模板量，同时保持
底漆经常过量。
 协议
突变链合成反应（热循环）
注意确保质粒DNA模板从DAM中分离出来。+
大肠杆菌菌株。大多数常用的大肠杆菌菌株
是大坝+。从DAM菌株（如JM110）分离出质粒DNA
SCS110）不适用。
为了大限度地提高温度循环性能，我们
建议使用薄壁管，确保理想接触
温度循环器的热阻。以下协议
使用薄壁管进行优化。
1。合成两个包含所需的
突变，两侧是未修改的核苷酸序列。净化这些
在以下步骤中使用前的寡核苷酸引物（参见
诱变引物设计）。
2。准备控制反应如下：
5微升10×反应缓冲液
pwHitescript 4.5-kb控制质粒5μl（25 ng）（5 ng/μl）
1.25微升（125 ng）寡核苷酸对照引物1
[34摩尔（100 ng/微升）]
1.25微升（125 ng）寡核苷酸对照引物2
[34摩尔（100 ng/微升）]
1微升dntp混合物
1.5微升液体试剂
34微升DDH2O（使终反应体积达到50微升）
然后添加：
1微升Quikchange闪电酶
三。制备样品反应，如下所示：
注：使用不同数量的
dsdna模板范围从10到100 ng（例如，10，25，50，
和100 ng dsdna模板）同时保持引物
浓度常数。
5微升10×反应缓冲液
dsdna模板的xμl（10–100 ng）
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）1
寡核苷酸引物的xμl（125 ng）2
1微升dntp混合物
1.5微升液体试剂
DDH2O，终体积为50μl

然后添加：
1微升Quikchange闪电酶
十一
4。使用表1中列出的循环参数循环每个反应。
（对于控制反应，延长2.5分钟。）
表一
定向QuikChange闪电场地的循环参数
诱变方法

例如，5-kb质粒在68°C条件下每个周期需要2.5分钟。

DPN I放大产物的消化
1。直接将2微升提供的DPN I限制酶添加到每个
放大反应。
注：仅使用所提供的DPN I酶；不得用
另一种来源的酶。
2。轻轻和*地混合每个反应混合物
上下解决方案多次。简单地降低反应速度
混合物，然后立即在37°C下培养5分钟以消化。
亲本（即非突变的）超压缩dsdna。
XL10金超能力细胞的转化
注意：在继续之前，请阅读转换指南。
转换协议。
XL10金细胞对四环素和
氯霉素。如果突变质粒只含有tetr
或抗camr标记，一种有能力细胞的替代品系。
必须使用。
1。在冰上轻轻融化XL10金超能力细胞。对于每一个
待转化的对照反应和样品反应，等分45微升
14 ml bd falcon聚丙烯的超能力细胞
圆底管。
2。将随试剂盒提供的2μlβ-Me混合物添加到45μl的
细胞。（使用β-Me的替代来源可能会减少转化
效率。
三。轻轻地旋转管中的内容物。在冰上培养细胞
2分钟。

4。从每个对照品和样品中转移2微升经dpn i处理的DNA。
对分离部分超能力细胞的反应。
作为可选控制，验证
通过添加1微升0.01 ng/微升puc18的XL10金超能力细胞
对照质粒（在水中稀释1:10的对照品）
另一个45-微升的小份细胞。
5。轻轻旋转转化反应，混合和培养
冰上反应30分钟。
注：此步骤的培养时间可缩短至
10分钟，转换过程中无重大损失
效率。
6。在A中预热NZY+肉汤（见介质和试剂的制备）
步骤9中使用的42°C水浴。
注：XL10金超能力细胞的转化
使用NZY+肉汤优化。
7。在42°C水浴中加热脉冲管30秒。持续时间
热脉冲对获得率至关重要。做
不超过42°C。
注：该热脉冲已优化用于
14毫升bd falcon聚丙烯圆底管。
8。在冰上孵育试管2分钟。
9。向每个试管中加入0.5毫升预热（42°C）NZY+肉汤，然后孵化。
管道在37°C下振动1小时，转速为225–250转/分。
十三
10。将每个转化反应的适当体积，如
下表所示，在含有适当
质粒载体的抗生素。
对于诱变和转化控制，将细胞传到
LB-氨苄西林琼脂平板，含80μg/ml x-gal和20 mm IPTG
（参见准备用于彩色筛选的琼脂板）。
转化反应电镀量

当电镀体积小于100μl时，在
琼脂平板，用移液管将小体积的转化反应移入池中，然后
摊铺混合物。
B撒布量根据
诱变质粒。通常对整个变换混合物进行电镀是有用的，
分为多个板，覆盖一系列电镀体积。
11。将转化板在37°C下培养16小时以上。
控件转换的预期结果
pwhitescript转换后的预期菌落数
4.5kb对照诱变反应>100个菌落。大于85%
菌落应含有突变，并在琼脂上呈蓝色菌落。
含有IPTG和X-Gal的板。
注意pwitescript 4.5-kb的诱变效率（Me）
对照质粒的计算公式如下：

如果对puc18控制质粒进行转化，
>应观察到50个菌落（>109 cfu/μg），其中>98%的菌落具有
蓝色表型。
样本转换的预期结果
预期菌落数取决于基组分和长度。
使用的DNA模板。关于增加殖民地的建议
编号，请参阅故障排除。插入感兴趣的内容应排序为
验证所选克隆是否包含所需的突变。

转型指导方针
储存条件
超能力细胞对温度的微小变化很敏感。
必须存放在-80°C冰箱的底部。从传输管道
一个冷冻室到另一个冷冻室可能会导致效率下降。超级电容器
电池应直接从干冰运输容器放置在-80°C。
对齐单元格
配药时，应始终将超能力细胞放在冰上。这是必要的。
把bd falcon聚丙烯管放在电池前的冰上
解冻后，细胞被直接分配到预成丘的试管中。
14毫升bd falcon聚丙烯圆底管的使用
重要的是14毫升bd falcon聚丙烯圆底管
（BD Biosciences Catalog_）用于转换协议，
因为其他试管可能会被β-巯基乙醇降解
转换协议。此外，热脉冲步骤的持续时间为
关键，并针对厚度和形状进行了专门优化
这些管子。
β-巯基乙醇的使用
β-巯基乙醇（β-Me）可以增加转化率。
效率。该试剂盒中提供的XL10金β-巯基乙醇混合物是
稀释后即可使用。
添加的DNA数量
当添加2μl合成物时，观察到大效率。
反应。当添加一个
尽管总效率可能
低一些。
热脉冲的长度和温度
有一个由热量产生的效率高的限定窗口。
转换过程中的脉冲。在细胞中观察到效率。
热脉冲30秒。不得超过42°C。
彩色筛选用琼脂板的制备
准备用于蓝白筛选的LB琼脂平板，添加80μg/ml。
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃甙（x-gal），20 mm
异丙基-1-硫-β-d-半乳吡喃苷（IPTG），以及适当的
LB琼脂的抗生素。或者，100μl的10 mm IPTG和100μl
2%的x-gal可以在电镀前30分钟在LB琼脂板上涂抹。
转变。用无菌的DH2O制备IPTG；用
二甲基甲酰胺（DMF）。之前不要混合IPTG和X-GAL
用移液管把它们移到盘子上，因为这些化学物质会沉淀。

故障排除
当根据本说明手册中概述的指南使用时，此套件提供可靠的
使用dsdna模板进行定点突变的方法。基础成分的变化
DNA模板的长度和热循环性能可能导致
诱变效率。

现货供应Agilent定点突变试剂盒

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是实验室中改造和优化基因常用的手段，对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入可以改变对应氨基酸序列和蛋白质结构，可以进一步了解蛋白质结构和功能之间的关系，探讨蛋白质的结构域。上海金畔生物常备品牌Agilent的各种定点突变检测试剂盒，并提供专业的技术支持，使您科研无忧！ 您只需要3个简单步骤即可在一天时间内，采用任何双链质粒、按设计要求获得（插入、删除、置换）突变体。

注解1：PfuUltra™高保真DNA聚合酶，Agilent货号：600380
由Pfu DNA聚合酶经基因工程改造而来，具有更佳的校验活力。数据显示PfuUltra™高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu turbo DNA聚合酶的三分之一，为普通Taq DNA聚合酶的十八分之一，是目前保真度高的PCR酶。该酶添加ArchaeMaxx聚合酶增强因子，显著提高产量、减少扩增时间，并可扩增更长的模板。

注解2：XL10-Gold超级感受态细胞具有Hte基因型，因此提高了连接DNA的转化效率。该细胞具有*的转化效率，尤适用于大质粒转化。这种细胞也比XL 1-Blue长得快，因此可以获得更大的克隆。

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