抗体亚型的鉴定
亚型指的是相同的构成方式，但是空间结构不同的蛋白质结构。抗体亚型，指的是在机体内产生的“Y”构型的免疫球蛋白（Ig），基于小分子多肽结构上的差异，可以进一步的进行细分。
抗体亚型
重链
抗体以一个或者多个“Y”字形单体存在,每个“Y”字形单体由 4 条多肽链组成,包含两条相同的重链和两条相同的轻链。 通常，抗体的种类由重链决定。例如哺乳动物 Ig 的重链一共有五种,分别用希腊字母α、δ、ε、γ和 μ 来命名,相对应组成的抗体就称为 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM。其中，人的γ可以进一步细分为γ1、γ2、γ3、γ4 等亚类，分别对应 IgG1, IgG2, IgG3 和 IgG4 四个亚型，小鼠γ可以进一步细分为γ1、γ2a、γ2b、γ3 等亚类，分别对应 IgG1, IgG2a, IgG2b 和 IgG3 四个亚型。
轻链
哺乳动物有两种轻链：λ型和κ型。出于科研的需要，人们也会对轻链的亚型进行鉴定。
表1 不同亚型抗体的结构与功能
抗体亚型鉴定
抗体亚型鉴定的原理是利用酶联免疫吸附实验（ELISA），测定待测抗体与不同亚 型特异性的抗体的结合情况，找出可以与待测抗体特异性结合的抗体，由于与待测抗体结合的抗体的特异性都是已知的，依据结合抗体的特异性可以得出待测抗体的亚型。以小鼠抗体亚型的测定为例，利用 ELISA 测定待测抗体与针对小鼠 IgG1、
IgG2A、 IgG2B、 IgG3、IgM、λ、κ有特异性的抗体的结合情况。如果待测抗体抗体可以与针对小鼠 IgG1 的特异性抗体结合（通过肉眼观察颜色深浅或通过测
OD 值判断），则该抗体的亚型为 IgG1。以此类推，也可以测出轻链的亚型。
鉴定方法
目前比较常用的方法是利用试剂盒进行抗体亚型的鉴定，按照试剂盒说明书进行操作，便可以直观的读出抗体的亚 型。
利用试剂盒鉴定抗体亚型常见问题与解决方法：
样本中抗体浓度过高再将样本 1:2-1:10 稀释
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常见问题 |
可能原因 |
解决方案 |
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多种重链结果 |
腹水中有杂抗体 杂交瘤细胞中含有多种细胞系 |
将腹水样本至少 1:100000 稀释亚克隆杂交瘤细胞 |
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结果难以判定 |
多种重链或轻链结果 |
再将样本 1:4 或 1:8 稀释后重新检测 |
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显色较慢或颜色较弱 |
样本中抗体浓度低 |
减少稀释倍数；延长显色时间 |
抗体亚型鉴定的意义
表 2：常见问题与解决方案
不同亚型的抗体在结构上有所区别，其免疫源性与在体内发挥的作用存在差异，对抗体进行进一步的细分，并进行 抗体亚型鉴定，对于疾病作用机理的研究、抗体药物的开发有重要意义。
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品牌：antagen/ Antagen Pharmaceuticals
货号：ISO-M8a
20个测试（测试16.50美元）Cat＃ISO-M8a-20
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小鼠同种型试剂盒 – 快速小鼠抗体同种型XpressCard（ISO-M8a）
ISO-M8a：每个试剂盒包含两个盒，一个用于IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3，另一个用于κ，λ，IgA和IgM。
效益：
快速小鼠免疫球蛋白同种型试剂盒是一种5分钟的侧流测定，具有ELISA敏感性，可用于单克隆抗体类别和亚类测定。它可以在一个快速测试中确定IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA和IgM，以及κ，λ。
可接受的样品类型：
包括杂交瘤培养上清液和纯化的单克隆抗体。不推荐腹水，因为它通常含有多种免疫球蛋白。然而，该试剂盒仍可用于确定腹水液样品中主要同种型的相对分布。
套件组件：
同种型试剂盒具有三种不同的大小，每个小袋含有两个盒子的5,10或20个小袋：一个盒子用于测定IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3，另一个盒子用于测定κ，λ，IgA和IgM。两个条带都包含一条控制线。
注意：
BALB / c和DBA小鼠产生IgG2a，而不是IgG2c。但是C57BL / 6，C57BL / 10，SJL和NOD产生IgG2c，而不是2a *。
1）将盒式磁带放在水平面上。
2）将80-100μL抗体溶液直接加入样品孔中。等待5分钟。
3）在对应于抗体特异性同种型的位置处的红色测试线和在“C”位置处的红色对照线将在1-5分钟内出现。
该测定 比传统的ELISA方法更快 更方便。
结果解读：
1.结果无效：“C”处没有红线。
2.否定结果：“C”处只有一条红线。
3.积极成果：
一个）。单一单克隆抗体：除阳性对照“C”系外，仅出现一条重链和一条轻链。
B）。多种单克隆抗体：除阳性对照系外，还会出现一条以上的重链和/或轻链。线强度可用于判断显性同种型。
表现：
低检测限为100 ng / m。每种同种型之间没有交叉反应性。
存储：
在室温下将条带存放在原始包装中。从认证日期起，该产品可稳定长达18个月。不建议冻结条带。
抗体亚型鉴定常见问题解析
一、单抗亚型鉴定(亚型,单抗,腹水,阳性克隆)
筛选出阳性克隆后，制备了腹水，可是鉴定亚型的时候，发现亚型不纯，有好几种，不知道是什么原因。亚型鉴定选用的是SBA的亚型分选试剂盒。腹水没有纯化，离心后直接测得。请大家帮我分析一下是什么原因？
答：你要测亚型必须用细胞培养上清或者是纯化后的抗体，不能用腹水：腹水的成分很杂，包含小鼠本身的IgG。另外还有可能是你的细胞株本身就不是单克隆，SBA的亚型试剂盒我没有用过，我用过sigma的是ELisa方法测定亚型，很不好用。用serotec试纸条或bethly免疫扩散效果很好；HBT的试纸条也不错，操作简单，2-3小时搞定，推荐用细胞上清来检测，不易出现多亚型误检。缺点是价格偏高；谢谢了。从大家的分析来看亚型不纯由以下原因产生：1.腹水需要纯化后再测亚型。2.单克隆筛选不纯。
二、单抗亚型鉴定为何全部是IgM
在小鼠免疫阶段，是按照经典方法进行免疫的：经过基础免疫，三次加强免疫（间隔三周），小鼠效价达到1：12800以上，末次冲击免疫三天后，取脾细胞与SP2/0细胞融合，然后根据间接ELISA检测效价上清结果和有限稀释法进行筛选和亚克隆，其中的酶标二抗用的是辣根酶标记的羊抗鼠IgG（Fc片段），三轮亚克隆后得到五铢全阳株，可是经过取他们的细胞上清进行亚型鉴定结果全是IgM。
三、抗体的亚型选择、恒定区序列改造-分子设计考虑
在抗体药物中IgG有4个亚型，本身具有的结构特点如Hinge序列及原本功能特点使其治疗应用上有较大区别。另外目前基因工程使得改造变为现实。
IgG3由于其半衰期比较短并且hinge区域易水解，限制其在药物中应用，但是也有文献提到做融合蛋白时增大柔性时会考虑使用。
需要ADCC和CDC效应的，优先选择IgG1，并且有细胞株敲除岩藻糖，使得ADCC效应增强，例如CD20抗体；
如果只是阻断抗体，不需要ADCC和CDC效应，优先选择IgG4，例如目前国外获批上市的PD-1抗体（Keytruda、Opdivo），均为IgG4，并且进行了S228P改造。IgG4存在的问题是容易形成半抗体（发生Fab-arm的交换），S228P的突变就是降低Fab-arm的交换。
目前也有部分抗体采用IgG2的，主要也是低ADCC和CDC效用。
IgG1亚型的选择这个话题很有意义，IgG1其实是现在成熟的，研究多的。IgG4亚型在近几年应用也慢慢增多，IgG4在通过S228P突变解决Fab-arm exchange后还有一个问题，就其稳定性不好，但是现在有很多成药的都在用IgG4，例如PD-1等等，不知道这一块如何解决？在制剂上下功夫？
关于IgG2这个成药的几乎，主要因为IgG2的二硫键错配问题，IgG2的二硫键远比IgG1和IgG4的复杂，如果想用IgG2亚型就得考虑二硫键的问题。
根据我们的经验，IgG4 Fc对于pH非常敏感，低pH时候非常容易发生沉淀（聚集），然而高pH容易发生脱酰胺。
糖基化对于抗体稳定性确实有比较大的影响，我们IgG4 Fc是在E.Coli表达的，从长期稳定性数据来看，好像影响不大（可能case by case），或许象你说的，去糖基化会对pH变得更加敏感。
制剂方面，我们重点考察了pH范围以及缓冲体系，避免聚集的发生
IgG4 Fc的Deamidation导致酸性峰增加，其主要原因可能是由于pH导致的。我们采用LC-MS/MS方法，鉴定结果显示酸性峰deamidation位点主要是NG和NS（G和S都是属于空间位阻较小的氨基酸）:
– EEQFNSTYR
– VVSVLTVLHQDWLNGK
– GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
上面是我们项目的数据，主要位于CH2区域，仅供大家参考。对于ADCC、FcRn、PK和免疫原性没有深入研究过，但是由于脱酰胺在人体中可天然发生，免疫原性应该不会有问题。