cosmobiousa高质量抗人类四跨膜蛋白单克隆

用抗人类四跨膜蛋白单克隆抗体和OptiPrep™进行外显子的

分离和鉴定

什么是外泌体？

细胞外囊泡（EV；包括经典的外泌体，非经典的外泌体，微囊泡，大的脂质体，凋亡小体，凋亡小泡，自噬性细胞外小泡，两性小体和ARRM）是释放到细胞外环境中的40-1000 nm的膜小泡。和来自大多数细胞类型的体液，包括红细胞，血小板，淋巴细胞，树突状细胞，内皮细胞和肿瘤细胞。这些囊泡根据其分泌机制分为两种。因此，经典囊泡在多囊泡内体中形成，而微囊泡则是从质膜上直接出芽而形成的。尽管经典外泌体成分因其起源的细胞类型而异，但无论它们的起源如何，似乎都可能共享某些分子。这些分子包括四跨膜蛋白（CD9，CD63和CD81），它们被认为是经典外泌体生物发生机制的重要组成部分。因此，研究人员已使用CD9，CD63和CD81来分离和表征经典外泌体制剂的纯度。

在过去的十年中，外泌体作为microRNA（miRNA）载体，疾病生物标志物和潜在的治疗性药物传递载体成为人们关注的焦点。尽管外泌体很重要，但它们的分离和鉴定仍然被认为是重大的科学挑战，特别是在转化为临床需求时。通常，外泌体和其他电动汽车已通过超速离心纯化。技术挑战，时间和成本已导致替代提纯方法的泛滥，其中许多现在可商购获得。虽然据报道外泌体含量包括基因组DNA，RNA，蛋白质和脂质， 

近的地标性论文（杰普森·D。，菲尼克斯·A。，富兰克林·J。希金博特姆·J。，张Q.，齐默曼·L。利勃勒·D。，平·J。，刘Q. Evans，R.，Fissell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌体组成细胞的重新评估177（2），428-445.e18。）结果表明，大多数外泌体分离方法（包括经典的超速离心分离法）都受到来自非囊泡细胞外来源的大量蛋白质和DNA污染的困扰。揭示这种令人惊讶的污染水平的方法包括高分辨率碘克沙醇密度梯度超速离心[将小型EV与非囊泡成分（如穹ault和外泌体）分离）以及使用抗体从人血浆和细胞条件培养基中直接免疫捕获（DIC）至四跨膜蛋白分子CD63，CD9或CD81。

  高质量抗人类四跨膜蛋白单克隆

冷冻电子显微镜检测与抗人CD63抗体结合的外泌体（克隆8A12）。
将外泌体和抗人CD63抗体（克隆8A12）混合并用冷冻电子显微镜（Titan Krios）成像。显示的是外泌体（A）的低温电子显微照片，利用单结合抗体（青色）对外泌体（绿色）进行的三维重建（B），以及外泌体和结合抗体的旋转3D层析成像重建（宜）。图片由冲绳蛋白质断层扫描有限公司提供。 

来自CosmoBio USA的高特异性抗人四跨膜蛋白抗体是使用新型“超净”方法表征和分离经典外泌体的理想试剂。

* Tide Fluor™2（TF2）的光谱特性与荧光素和AlexaFluor®488（Invitrogen）相似。与荧光素相比，TF2具有更强的荧光和更高的光稳定性。另外，它的荧光在pH 3到11之间与pH无关。与FITC标记的抗体相比，TF2标记的抗体显示出更强的荧光和更高的光稳定性。这些特性使TF2成为荧光素的替代品。 
＃Tide Fluor™5（TF5）具有与Cy5相同的光谱特性。与Cy5相比，TF5具有更强的荧光性和更高的光稳定性。此外，其荧光在pH 3至11之间与pH无关。与Cy5标记的抗体相比，TF5标记的抗体显示出更强的荧光和更高的光稳定性。这些特性使TF5成为Cy5的替代品。 

具有四跨膜蛋白抗体的经典外来体的超净直接免疫亲和捕获（DIC）

收集后立即将细胞条件培养基在4℃下分别以400× g，2,000× g和15,000× g进行离心分离。将上清液通过0.22mm孔的PES过滤器（Millipore）过滤以产生预先澄清的培养基。随后的所有步骤也都在4°C下进行。如上所述，直接从人血浆中提取外来体的DIC，不同的是在这些情况下，上清液是未经处理，未经稀释和未经过滤的血浆（两轮3000 x g产生离心15分钟）。将预先清除的培养基分为三种方式：将一部分与直接与针对CD63，CD81或CD9的抗体缀合的磁珠一起孵育；将第二部分与缀合有小鼠IgG的磁珠一起温育，并允许温育并进行章动和旋转16小时。将第三部分进行超速离心和洗涤以产生粗制的sEV沉淀物（P120）。孵育后，将珠子在冰冷的0.1％BSA-PBS（pH 7.4，通过0.22mm膜过滤）中洗涤四次，后，在PBS pH 7.4（pH 7.4，通过0.22mm膜过滤）中洗涤一次。 ）。后一次洗涤后，立即将负载有外泌体的珠子重新悬浮在细胞裂解缓冲液和LDS样品缓冲液中，在冰上放置30分钟，然后重悬于LDS样品缓冲液中，然后加热至70°C 10分钟以释放蛋白质。通过使用磁铁从悬浮液中除去珠子，并将澄清的裂解物用于免疫印迹分析。在某些情况下，在后的洗涤步骤之后，立即将装载了外来体的珠子裂解以提取DNA。 
（摘自：耶普森D.，菲尼克斯A.，富兰克林J.，希金博瑟姆J.张Q.齐默曼L.利勃勒D.平J.刘Q.埃文斯R.，Fissell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌体组成细胞的重新评估177（2），428-445.e18。） 单击此处

ExoTrap™旋转柱

CosmoBio USA的ExoTrap™外泌体分离旋转柱试剂盒使用旋转柱固定的抗人CD9抗体（克隆12A12）捕获外泌体。可以在30分钟内从人血清，血浆，唾液，尿液和培养上清液中分离出外来体来源的蛋白质和微RNA。 特征：

• 从血清，血浆，尿液，唾液，培养上清液中回收外泌体
• 30分钟内高纯度外泌体
• 旋转柱操作简单

实验实例 
使用ExoTrap™外泌体在50ul SDS样品缓冲液中回收。通过蛋白质印迹分析外泌体标志物表达。 图1.从培养上清液中分离外来体。用抗-CD9（克隆12A12），抗-CD63（克隆8A12）和抗-CD81（克隆12C4）探测293T细胞培养上清液和MKN7细胞培养上清液（20ul /泳道）。图2.从人血浆中分离外来体。用抗CD9（克隆12A12）探测EDTA处理的人血浆（20ul /泳道）。

OptiPrep™（碘克沙醇

纯化外泌体的宜密度梯度培养基

OptiPrep™是60％碘克沙醇在水中的无菌内毒素测试溶液，密度为1.32 g / ml。 

碘克沙醇是作为X射线造影剂开发的，因此已经进行了严格的临床测试。它是非离子性的，对细胞无毒并且在代谢上是惰性的。碘克沙醇溶液可以在所有有用的密度下制成等渗的。碘克沙醇溶液的粘度和重量克分子渗透压浓度低。 

Optiprep™使用高分辨率密度梯度超速离心技术进行外来体纯化

高分辨率（12％–36％）碘克沙醇密度梯度分级分离膜封闭的sEV与非囊泡（NV）组分将 OptiPrep™（碘克沙醇）密度介质在冰冷的PBS中立即制备，然后用于产生不连续步骤（12 ％–36％）的渐变。将sEV的粗颗粒（P120）重悬于冰冷的PBS中，并与冰冷的碘克沙醇/ PBS混合，制成终的36％碘克沙醇溶液。将悬浮液添加到离心管的底部，将碘克沙醇浓度递减的PBS溶液小心地铺在顶部，产生完整的梯度。以相同的方式生成没有样品的相同梯度，以用于稍后确定馏分密度。底部负载的12％–36％梯度在120,000 x下进行超速离心
g下使用SW41 TI摆动铲斗转子（k因子124，贝克曼库尔特）在4°C下放置15h。从梯度的顶部收集了12个1 mL的馏分。使用折射计（ATAGO，东京，日本）从重复的梯度测量分数密度。对于纳米颗粒跟踪分析（NTA），将级分合并并在无颗粒PBS中稀释。为了进行免疫印迹，将每个单独的1 mL馏分转移到新的超速离心管中，在PBS中稀释12倍，然后以120,000 x g的速度进行超速离心使用SW41 TI摆动铲斗转子在4°C下放置4h。将所得沉淀在冰上的细胞裂解缓冲液中裂解30分钟。对于RNA和DNA提取，将级分合并，转移至新的超速离心管中，在PBS中稀释约6倍，并使用SW 32 Ti摆动桶转子在4°C下于120,000 x g进行超速离心4小时。 （摘自：耶普森D.，菲尼克斯A.，富兰克林J.，希金博瑟姆J.张Q.齐默曼L.利勃勒D.平J.刘Q.埃文斯R.，Fissell，W.，Patton，J.，Rome，L.，Burnette，D.，Coffey，R.（2019）。外泌体组成细胞的重新评估177（2），428-445.e18。）

Optiprep™应用说明

1. 条件培养基中的哺乳动物细胞外泌体和其他微泡
2. 来自非哺乳动物来源的细胞外囊泡
3. 细胞内外囊泡运输和囊外复合物-方法学概述
4. 制备突触小体，突触小体，神经黑色素颗粒和突触小泡–方法学调查
5. 从各种来源分离水泡和颗粒部分

用户报告

四跨素抗体

西田青树（Nao Nishida-Aoki） 
国家癌症中心分子与细胞治疗研究所

实验发现

外泌体是脂质双层限定的直径约100nm的囊泡。癌细胞通过分泌促进癌症侵袭和转移的外来体，对周围细胞产生不利影响。我们想知道抑制癌细胞来源的外泌体功能是否会抑制癌症转移。为此，我们使用了与外泌体结合的抗体来抑制源自癌细胞的外泌体的作用。

寻找能识别人乳腺癌细胞外来体的抗体用于具有人乳腺癌细胞的小鼠异种移植模型。首先，我们要检查抗人CD9和抗人CD63是否会结合到从乳腺癌细胞条件培养基分离的外泌体表面。外泌体的小尺寸阻止了常规显微镜的使用。因此，有必要采用免疫电子显微镜。但是，免疫电子显微镜具有挑战性，需要与靶标结合良好的抗体。

抗人CD9（克隆12A12）和抗人CD63（克隆8A12）在免疫沉淀方面具有良好的记录，因此有望在免疫电子显微镜中进行测试。这些试剂很容易检测到CD63。但是，检测CD9之前，需要进行实质性修改，才能成功染色（图1）。另外，出于该实验的目的，重要的是所选抗体对人类而非小鼠具有*的特异性，以防止毒性和脱靶效应。在蛋白质印迹实验中发现该抗体具有非常强的人特异性，可以轻松检测到来自人而非小鼠的CD9和CD63（图2）。

建立了两种抗体的检测方案和人类特异性后，有可能进行体内研究。在乳腺癌的鼠异种移植模型中施用抗人CD9（克隆12A12）和抗人CD63（克隆8A12），以确定是否有可能抑制转移。在此模型中，我们能够成功抑制癌症转移（参考文献1）。我们认为该实验的成功*归因于我们使用的高质量抗体。我希望这些抗体能够帮助更多的人进行研究。

数字

图1.免疫电子显微镜检测外泌体表面上的人CD9和CD63蛋白 
（A）抗人CD9抗体（克隆12A12）在人乳腺癌细胞的外泌体表面上检测到CD9。（B）抗人CD63抗体（克隆8A12）还在人乳腺癌细胞的外泌体表面检测到CD63。 图2.人类和小鼠CD9和CD63蛋白的蛋白质印迹法使用 抗人类CD9抗体（克隆12A12），抗人类CD63抗体（克隆8A12），抗小鼠CD9抗体和抗小鼠CD63抗体来探测含有来自人乳腺癌细胞系（MDA-MB-231-lucD3H2LN）和鼠类乳腺癌细胞系（4T1-luc）的裂解物。

参考文献

1. 西田青木（Nishida-Aoki，N.），富永（N. Tominaga），竹下（F.Takeshita），园田H. （2017）循环中的细胞外囊泡破坏作为一种针对癌症转移的新型治疗策略，Mol Ther，25：181-91。

小坂伸吉国立 
癌中心
分子细胞治疗研究所

实验发现

外泌体是直径约100 nm的小细胞外分泌脂质双层分隔的囊泡。ISEV（细胞外囊泡学会）建议使用术语细胞外囊泡（EVs）来指代分泌性囊泡的异质类，其中包括衍生自多囊泡内体的囊泡。近的外泌体研究已经开始阐明外泌体在某些疾病中的作用。但是，要了解外泌体的产生机理，必须具有：1）生理学上了解外泌体的作用；2）了解外泌体引起的疾病。阐明癌细胞外泌体分泌的机制可能导致新的癌症治疗方法。

为了追踪外泌体产生的动力学，我们使用抗人CD63抗体（克隆8A12；可从Cosmo Bio USA获得）进行免疫染色实验。使用免疫荧光显微镜，我们在前列腺癌细胞系PC-3M（图1）和结肠癌细胞系HCT116（图2）中观察到许多CD63阳性颗粒样结构。将来，我们将癌细胞与抗人CD63抗体（克隆8A12）和其他内体标记物抗体共同染色，以探索癌细胞产生外泌体的能力。抗人CD63抗体（克隆8A12）的高特异性使其可以成功用于体内靶向外泌体以抑制癌症转移。

数字

图1. CD63在前列腺癌细胞系PC-3M中的 
定位通过Alexa Fluor™488标记的抗小鼠二抗检测到抗人CD63抗体（克隆8A12）。 图2. CD63在结肠癌细胞系HCT116中的定位通过Alexa Fluor™488标记的抗小鼠二抗检测到抗人CD63抗体（克隆8A12）

吉冈雄介 
国立癌症中心研究所

实验发现

1975年，乔治·科勒（George Kohler）和塞萨尔·米尔斯坦（CésarMilstein）发明了单克隆抗体生产技术，并因此在1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。单克隆抗体*改变了制药业，为新型诊断和靶向疗法打开了大门。它不仅有益于医学实践，也有益于基础研究。并非所有的单克隆抗体都等效。对于每种特定的应用，识别“好”抗体很重要。通常，“好”抗体是识别单个分子并与其分子靶标牢固结合的抗体。

在外泌体研究中获得“良好抗体”尤为重要。外泌体是脂质双层分隔的囊泡，直径约100 nm，在其管腔和膜中含有各种蛋白质。使用免疫电子显微镜，免疫印迹，ELISA，免疫沉淀和免疫亲和柱，已使用抗体来检测和分离体液或培养上清液中的外泌体。这些应用需要“优质”抗体。

由于外泌体是异质的，因此根据其来源，它们可能会展示并包含不同的分子。但是，蛋白质的一个子集很可能在不同类型的外泌体之间共享。目前，好的泛外泌体标记是四跨膜蛋白CD9，CD63和CD81。我的外泌体研究始于构建外泌体检测系统的目标。我努力寻找在我的检测系统中识别外泌体标记的单克隆抗体。尽管我尝试了许多克隆，但直到发现抗CD9（克隆12A12）和抗CD63（克隆8A12）（图1和参考2），我都没有获得好的结果。这些抗体在蛋白质印迹（图2）和免疫电子显微镜中表现良好。这些抗体的人类特异性由其无法检测小鼠CD9和小鼠CD63证实。该特性在小鼠的人异种移植模型系统中很有用，在这种系统中，抗体不会与内源性CD9和CD63反应。如果在检测人外泌体时遇到问题，则抗CD9（克隆12A12）和抗CD63（克隆8A12）抗体可能会有用。

数字

图1.克隆12A12（抗CD9）和8A12（抗CD63）相对于竞争对手克隆A和B的ELISA性能。 图2.克隆8A12（抗CD63）和12A12（抗CD9）的免疫印迹性能人类外泌体。

参考文献

1. 吉冈Y等。（2013）J Extracell Vesicles ，2：20424
2. 吉冈Y等。（2014）Nat Commun，5：3591

高桥彰子 
癌症研究基金会

实验发现

外来体通过ESCRT复合物的作用从多囊泡内体中包含的囊泡中产生。这些腔内囊泡被分泌为直径为50-150nm的细胞外囊泡。近来，随着外泌体包含蛋白质，脂质和核酸的发现，许多注意力集中在它们作为细胞间通讯载体的功能上。

我们正在分析衰老相关的分泌表型，其部分特征是炎症细胞因子和趋化因子的分泌增加。衰老细胞还提高了外泌体的分泌（参考文献1）。我们通过正常人成纤维细胞的连续传代（复制性衰老）和引入激活的癌基因RasV12（癌基因诱导的衰老）来诱导细胞衰老。温育48小时后，通过超速离心回收条件培养基中的外来体。回收的细胞外物质的大小分布通过纳米颗粒跟踪分析进行表征。衰老细胞中分泌的外泌体的数量是年轻细胞的30​​至50倍（图1，顶部）。为了进一步比较衰老与年轻外来体，我们使用抗人CD81单克隆抗体（克隆12C4，以1：1000稀释度使用；来自Cosmo Bio USA）进行了蛋白质印迹实验。结果表明，从衰老中回收的CD81蛋白量相对于年轻外来体有所增加（图1，底部）。还观察到从衰老细胞中回收的外泌体对MCF-7乳腺癌细胞具有促进生长的作用（参考文献2）。

外泌体的生理作用和诊断/治疗潜力仍未*了解。我们正在分析正常细胞和衰老细胞分泌外泌体的详细分子机制，以期阐明外泌体的生物学意义。此外，通过研究衰老 

数字

人类成纤维细胞TIG-3细胞年轻和衰老版本的外泌体分析（来自参考文献1）。
上图：通过NTA（纳米粒子跟踪分析）确定的回收的外泌体的相对数量。下图：外泌体标记蛋白的蛋白质印迹检测。

参考文献

1. Takahashi，A.等。外泌体通过从细胞中排出有害DNA来维持细胞稳态。纳特COMMUN 8，15287（2017）。
2. 高杉，M。等。衰老细胞分泌的小细胞外囊泡通过EphA2促进癌细胞增殖。纳特COMMUN 8，15729（2017）

EXOTRAP™外来体分离离心柱套件

名古屋大学医学研究科
病毒学
研究科佐藤佳隆

实验发现

外泌体是膜包裹的30至100 nm的囊泡，内含蛋白质和核酸，并由各种细胞分泌。通过获取循环的通路，它们可以将信号传输到远处的小区。已经观察到，通过外来体的细胞间通讯与抗原呈递，细胞凋亡，炎症，肿瘤进展和恶性转化有关。预计外泌体将在各个领域中发挥重要作用，例如在药物输送系统的开发中。

我们对病毒感染的细胞与附近未感染的细胞之间的相互作用感兴趣。当病毒感染的细胞与未感染的细胞混合培养后，荧光免疫染色可以检测未感染细胞中的病毒蛋白，呈点状信号。从这个发现，我对作为细胞间通讯介体的外泌体产生了兴趣。

由于涉及冗长而困难的方法（传统上包括超速离心），因此比较从各种来源和在不同条件下回收的外泌体具有挑战性。因此，从操作简便（任何人都可以纯化），纯化时间（可以在短时间内完成纯化）和应用的多功能性（可以分析外泌体本身以及所含蛋白质和核酸）的角度出发，我们进行了商业化探索可用的外泌体纯化试剂盒，发现CosmoBio USA的“ ExoTrap™外泌体分离旋转柱试剂盒”是理想的纯化解决方案。

ExoTrap™的优势在于，可以在仅30分钟的“短时间内”从少量样品中纯化外泌体。作为外泌体研究的初学者，ExoTrap™使我能够通过蛋白质印迹法检测与在纯化前培养上清液中无法检测到的外泌体相关的病毒蛋白。而且，我能够证明在从外泌体抑制剂（GW4869）处理过的细胞的培养上清液中回收的ExoTrap™纯化的外泌体中未检测到病毒蛋白（1）。尽管ExoTrap™可能不适合廉价地纯化大量外泌体，但强烈建议从小体积快速简便地纯化外泌体。 

数字

图1.外泌体纯化之前和之后以及用外泌体抑制剂处理之前和之后的
Western印迹（A）Western印迹显示“ ExoTrap™外泌体分离旋转柱试剂盒”纯化的外泌体中LMP1和Hsp70的表达。
（B）Western印迹显示“ ExoTrap™外来体分离旋转柱试剂盒”纯化的外来体中LMP1和Hsp70的表达，这些细胞来自用或未用外来体抑制剂（GW4869）处理的细胞培养上清液。

参考文献

1. Sato et al。，Oncotarget，8; 39345-39355、2017年

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