Cryodropper-E 80010 小鼠胚胎玻璃化说明

小鼠胚胎玻璃化：

1.胚胎在 M2 中保存在 37°C 直到冷冻保存。

2.制作玻璃化和预玻璃化培养基。

3.设置便携式 LN₂ 气相冷冻机。[我们使用泡沫聚苯乙烯冷却器并漂浮。]

4.标记每个 Cryodropper-E。[我们只对灯泡部分进行颜色编码或标记。]

5.在 Cryodropper-E 灯泡中预加载 100µl 0.5M 蔗糖 M2。将 100µl 滴放在培养皿上，然后移液器放入 Cryodropper-E。握住 Cryodropper-E 的开口端，轻轻将介质轻弹到灯泡部分。轻轻挤压灯泡以去除胚胎装载区域中残留的任何介质，并用 Kimwipe 擦去液体。使用与之前相同的方法或使用凝胶加顶端轻轻定位一滴，将 <5μl 玻璃化介质预加载到吸管区域的中心。在 Eppendorf 架子上开放存储。

6.在35mm培养皿的盖子上，装入一滴M2（每滴20-30μL）、一滴预玻璃化溶液和一滴玻璃化溶液。

7.标记低温储存瓶并预冷。[我们使用 4 毫升冷冻管并根据需要贴上标签。每瓶可装 4 个 Cryodropper-E。]

8.胚胎首先被转移到 35mm 培养皿中的 M2 滴。

9.用少量预玻璃化溶液预填充胚胎移液管。在解剖显微镜下，将胚胎从 M2 滴转移到预玻璃化溶液滴。

10.孵育30 秒。

11.用少量玻璃化溶液预填充胚胎移液管。将胚胎从玻璃化冷冻溶液滴转移到玻璃化冷冻溶液滴。

12.孵育30 秒。

13.收集胚胎并将它们装入预装在 Cryodropper-E 中的玻璃化溶液中。[它有助于将显微镜聚焦在移液管中的胚胎上。]

14.用热封机在末端密封 Cryodropper-E。[轻轻测试以确保设备已密封，如果没有，请再次密封。]

15. 将Cryodropper-E 放入 LN₂ 中，直到灯泡中的培养基冻结（@10 秒）。储存在 LN₂ 蒸气中的筏子上，直到处理完所有样品。转移到小瓶中。

16.然后将小瓶转移到 LN 2 杜瓦瓶中并储存在气相中。

玻璃化小鼠胚胎的解冻：

1.为每个 Cryodropper-E 准备解冻盘，如下所示：一个 60mm 的盖子，顶部有空间（M2 中 0.1 mL 的 0.5 M 蔗糖），然后每个顺时针滴 20-30μl：M2 中的 0.5M 蔗糖，0.25 M2 中的 M 蔗糖和 M2（2 滴）。准备孵化盘如下：60 毫米盘与 100μl KSOM 拉长滴通过中心，30μl KSOM 滴在培养前洗涤胚胎的任一侧。用石蜡覆盖并在 37°C 下用 5% CO₂ 平衡至少 30 分钟。

2.将装有 Cryodropper-E 的小瓶从储存容器中取出并保存在 LN 2 蒸气中直至准备解冻。

3.将 Cryodropper-E 浸入 37˚C 的水浴中，直到滴管中的培养基解冻（@10 秒）。

4.切下 Cryodropper-E 的顶端，将胚胎放置在培养皿上。将 Cryodropper-E 球茎中的 0.5M 蔗糖 M2 轻轻向下弹到吸管上，然后从 Cryodropper-E 排出到胚胎液滴中，从而最大限度地减少气泡。使用预装在 M2 中的 0.5M 蔗糖的胚胎移液管立即从液滴中收集胚胎。

5.胚胎被转移到一滴新的 0.5M 蔗糖的 M2 溶液中，然后孵育 2 分钟。

6.使用预装有 0.25M 蔗糖 M2 的胚胎移液管，将胚胎快速转移到 M2 中的 0.25M 蔗糖滴中，再孵育 2 分钟。

7.使用预装有 M2 的胚胎移液器，将胚胎快速转移到第一滴 M2 中并孵育 1 分钟。

8.然后将胚胎通过最后一滴 M2，通过 2 滴 KSOM，然后转移到油下的长滴 KSOM。

9.胚胎在 37°C 和 5% CO₂ 条件下培养（桑椹胚晚期或囊胚阶段培养 2 天）。

参考文献：改编自 Wai Hung Tsang 和 King L. Chow 的 B. Stone，BioTechniques Protocol Guide 2010（第 55 页）doi10.2144/000113258。

Cryodropper-E 80010 和 Cryodropper-S 80020 

设备：

• 用于胚胎玻璃化的 Cryodropper-E（黑线：ParaTechs 80010）
• Cryovial （4 ml）或其他合适的 LN₂ 储存选项（USA Scientific 1440-9100）
• 37˚C 的CO₂ 培养箱
• 玻片加热器或 37˚C 培养箱
• 水浴@ 37°C（500 毫升烧杯水在 37°C 培养箱中效果很好）
• 移液器和吸头；例如：1ml、200ul、20ul、2ul 
• Eppendorf 管、架
• 带泡沫聚苯乙烯筏的便携式 LN₂ 气相冷冻机（见下图）

• 用于标记的细尖Sharpie 
• Kimwipes 
• 组织培养皿；35 毫米、60 毫米
• 胚胎处理移液器和口移液器
• 带可调光源的立体显微镜
• 计时器
• 脉冲热封机（美国国际电气 AIE-105T）
• 镊子
• 剪刀
• LN₂ 气相储存杜瓦瓶
• 用于灭菌的0.22 微米过滤装置（例如： Millipore SCGVUORE 和 SLGP033RS) 
• 用于介质存储的冰箱/冰柜

所需培养基和试剂：

• M2培养基（Millipore MR-015-D）
• Ficol PM70（Sigma-Aldrich F2878）
•蔗糖（Sigma-Aldrich S1888）
•乙二醇（Sigma-Aldrich 102466）
•二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich D2650）
• 0.5 M 蔗糖
• FS 
• Pre-VS 
• VS 
• 0.25M 蔗糖
•石蜡油(Sigma-Aldrich 18512) 
• KSOMᴬᴬ培养基 (Millipore MR-121-D)

Cryodropper-E 80010 配方： 

PARATECHS 公司有限保修

ParaTechs 保证，在发货时，产品将符合产品随附的规格。本保证限制了 ParaTechs 更换产品的责任。  PARATECHS 对产品不作任何其他明示或暗示的保证；包括对任何特定用途的适销性或适用性的任何保证，或者产品不会侵犯任何第三方的任何专有权利。

Cryodropper-S 80020 小鼠精z冷冻保存说明

精z冷冻：

1.在精z冷冻保存前 4-7 天，通过交配（插头阳性）准备 2 只雄性小鼠（>8 周龄，已证明具有生育能力）。

2.将 60μl CARD CPA 滴在 35mm 培养皿上，为每只小鼠准备 1 个精z培养皿。用石蜡油覆盖液滴。将第二个 60μl 等分的 CPA 添加到第一滴中，制成高大的半球形 CPA 滴。在 37 ̊C 下平衡（不在 CO₂ 中）。

3.标记每个冷冻滴管。[我们只对灯泡部分进行颜色编码或标记。]

4.准备 Cryodropper：在培养皿中制备 90μl CARD PM 培养基，每个 Cryodropper 1 滴。在 37°C 和 5% CO₂ 下平衡 10 分钟。通过移液将液滴加载到滴管中，然后轻轻地将介质轻弹到灯泡部分。轻轻挤压灯泡以去除精z装载区域中残留的任何介质，并用 Kimwipe 擦去液体。在 37 ºC 和 5% CO₂ 的条件下，将开口存放在 Eppendorf 架子中，直到上样。

5.用 LN₂ 设置冷冻箱并使其冷却。

6.标记低温储存瓶并预冷。[我们使用 4 毫升冷冻管并根据需要贴上标签。每个小瓶可装 4 个冷冻滴管。]

7.对小鼠实施安乐s。

8.去除附睾尾。将它们放在 Kimwipe 上，并在显微镜下*去除所有脂肪和血液。

9.将每个男性的一根附睾转移到每个精z培养皿中。这使来自两个男性的精z混合在精z盘中。注意：以下步骤必须快速执行；从精z释放到冷冻总共不到 30 分钟。

10.使用制表钳和小角度剪刀，在每个附睾至少做 6 个切口。

11.将培养皿放在载玻片加热器上，以 37 ºC 加热 3 分钟。每分钟旋转盘子以从组织中分散精z。当组织从培养基中取出时，轻轻地从组织中挤压剩余的精z。

12.装载冷冻滴管：使用凝胶装载移液器，小心地将 10μl 精z悬浮液的吸管部分装载在中心。用热封机密封。将加载的原型直接放在 LN2 蒸气中的浮子上 10 分钟。

13.将冷冻滴管转移到小瓶中。然后将小瓶转移到 LN 2 杜瓦瓶中并储存在气相中。

精z解冻：

1.从 LN₂ 存储中取出 Cryodropper。

2.浸入 37°C 水浴直至解冻并孵育 10 分钟。

3.从水浴中取出设备并用 Kimwipe 轻轻擦干。

4.用剪刀剪掉冷冻滴管的顶端，将精z滴转移到新鲜的试管婴儿培养皿中。

5.轻轻晃动手腕，轻轻摇动 CARD PM 介质至设备末端。[用力过猛，介质会丢失。]

6.在精z滴上涂抹培养基。[注意：如果使用试管婴儿培养皿，则应通过外腔中的水保持湿度。如果使用普通的培养皿，精z滴应该在精z解冻前用在 CO₂ 培养箱中平衡的石蜡覆盖至少 30 分钟。]

7.在 CO₂ 培养箱中在 37 ºC 下培养以使其容量化。[我们通常需要大约 45 分钟。]

参考资料：

改编自 Behringer R、Gertsenstein M、Vintersten K、Nagy A. 的 B. Stone，2014 年。操纵小鼠胚胎：实验室手册，第 4 版。冷泉港（纽约）：冷泉港实验室出版社。

Cryodropper-E 80010 和 Cryodropper-S 80020 

所需媒体：

• 石蜡油，(Sigma-Aldrich 18512) 
• FERTIUP 冷冻保护剂 (CPA) (Cosmobio KYD-001)（也可以内部制造，Behringer 等人，第 674-675 页）
• FERTIUP 预培养培养基 (PM)（Cosmobio KYD-002）（也可以在内部制造，Behringer 等人，第 614 页）

设备：

• 用于精z玻璃化的
冷冻滴管（红线：ParaTechs 80020）• 冷冻管（4 ml）或其他合适的 LN2 储存选项（USA Scientific 1440-9100）
• 37 ̊C 的 CO₂ 培养箱 • 玻片
加热器或 37 ̊C 培养箱
• 水浴 @ 37 ̊ C （在 37°C 培养箱中加入 500 毫升烧杯水效果很好）
• 凝胶加载
吸头（例如：USA Scientific 1022-0600）• 移液器和吸头；例如：1ml、200ul、20ul、2ul 
• Eppendorf 架
• 带泡沫聚苯乙烯筏的便携式 LN₂ 气相冷冻机（见下图）

• 用于标记的Sharpie 
• Kimwipes 
• 组织培养皿；35 毫米，IVF 培养皿（可选）
• 立体显微镜
• 计时器
• 脉冲热封机（美国国际电气 AIE-105T）
• 镊子（制表师 #5）
• 剪刀，解剖和小角度
• LN2 气相储存杜瓦瓶

动物：

• 用于精z采集的雄性小鼠（证明生育能力，采集前 4-7 天交配）