trilink基因编辑

基因组编辑已成为治疗发展中令人兴奋的新领域之一。存在多种用于基因组编辑的工具。簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/ Cas9由于其高效和易用性，已成为受欢迎的基因组编辑工具。Cas9 mRNA与指导RNA的共转染导致双链断裂，可以通过非同源末端连接（NHEJ）修复，从而导致使目标基因失活的插入缺失。如果与切割位点具有同源性的供体DNA模板也被共转染，则同源性指导的修复可导致基因校正或插入。

TriLink提供了三种类型的Catalog mRNA，用于CRISPR基因组编辑。对于CRISPR / Cas9基因编辑，这些包括具有未修饰碱基的Cas9 mRNA以及经5-甲氧基尿苷修饰以减少先天免疫应答的Cas9 mRNA。我们还提供经5-甲氧基尿苷修饰的Cas9切口酶。Cas9切口酶具有D10A氨基酸突变，可防止DNA链之一的切割。结果，Cas9切口酶产生单链切口，而不是双链断裂。DNA的切割或编辑通过约100个核苷酸的单个引导链RNA（sgRNA）定向到特定的染色体位置。CRISPR的另一种核酸酶是Cas12a。CRISPR / Cas12a基因编辑使用约42个核苷酸的RNA导链。TriLink提供未修饰的Cas12a或5-甲氧基尿苷修饰的Cas12a mRNA。 

我们的基因编辑工具中包括Cre重组酶，这是一种酪氨酸重组酶，可催化两个loxP位点之间的重组。由于Cre介导的重组，两个都包含loxP位点的独立DNA物种可能发生融合事件。Cre可用于将DNA序列插入包含loxP位点的基因组。它也可用于细胞标记研究，其中Cre表达激活了转基因小鼠品系中loxP位点侧翼的无活性报告基因。然后，用Cre mRNA转染的细胞将表达报告基因，并揭示哪些细胞被高效转染。

成簇的规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）迅速成为基因组编辑领域受欢迎的工具。CRISPR已被适配用于细菌抗噬菌体免疫系统的哺乳动物细胞。

TriLink CRISPR工具套件包括两个组件：一个是由Cas9或Cas12a mRNA编码的CRISPR核酸酶，第二个是向导RNA。实际上，Cas9指南由CRISPR RNA（crRNA）和反式CRISPR RNA（tracrRNA）组成。为了简化和提高效力，研究人员将这两个RNA融合为一个约100个核苷酸的单个RNA，他们将其称为单个向导RNA（sgRNA）。与Cas9相比，Cas12a使用约42个核苷酸的单个引导RNA。

当将Cas9或Cas12a mRNA和sgRNA共转染到细胞中时，引导链将Cas9或Cas12a蛋白导向基因组中的特定位置，然后在Cas9中产生双链断裂。Cas9切口酶mRNA编码具有D10A突变的Cas9，该突变导致单链切口而不是双链断裂。这可能导致较少的脱靶效应。

嵌合抗原受体（CAR）T细胞已被用作血液肿瘤临床治疗的过继性T细胞疗法（ACT）免疫疗法之一。近，它们也已经应用于实体瘤。

通常对CAR构建体进行修饰，使其包含单链抗体片段（scFv）结合结构域，跨膜结构域，以及通过独立于主要组织相容性复合物（MHC）的细胞内信号传导域激活T细胞的能力。修饰的T细胞在细胞表面表达CAR，其在治疗期间识别肿瘤相关抗原。

从要治疗的患者中收集大多数CAR T细胞的原始材料（自体移植）。扩增并修饰收获的细胞以表达CAR。CRISPR通常用于在TRAC（T细胞受体α常数）位点特异性插入位点，取代内源性T细胞受体。自体移植可避免排斥反应和移植物抗宿主病，但这些细胞通常来自病情较重的患者，因此效力可能不及健康供体所收集的细胞。另一种通用的现成解决方案是使用来自健康，同种异体供体的修饰细胞。这提供了一种途径来克服高昂的成本，一定程度地减少制造复杂性，缩短治疗时间并解决患者健康和生物安全问题。

然而，为了防止这些外源细胞的排斥，需要通过CRISPR进行广泛的基因缺失。CRISPR-Cas工程提供了下一代CAR T细胞解决方案，可以沉默或破坏任何所需的基因组基因座，使移植物抗宿主病（GvHD）和排斥反应小化，敲除检查点受体，增强抗肿瘤反应等。今天的CRISPR-Cas工程CAR T细胞在治疗感染性疾病，自身免疫性疾病和提高移植耐受性方面具有治疗潜力。

TriLink为CRISPR提供了几种未经修饰或经5-甲氧基尿苷（5moU）修饰的mRNA，以减少先天免疫应答。在该领域*的研究人员的帮助下，这些序列已进行了序列优化，以实现良好表达。TriLink还生产锌指核酸酶和转录激活因子样效应子核酸酶（TALEN）mRNA，用于生产CAR T细胞疗法。当您准备将研究成果转移到临床时，TriLink会在我们的cGMP设施中提供GMP合成的导链和核酸酶mRNA。

重组酶

位点特异性重组酶是用于操纵基因组以及有条件地激活或去激活细胞和生物体中基因表达的有用工具。重组酶识别约30-40个核苷酸的短目标DNA序列，并催化定向DNA交换反应。由于识别位点在高等生物的基因组中并不常见，因此可以用作工程改造基因组的工具。然而，重组酶在细胞或体内的持续表达可能会导致毒性和不合需要的脱靶重组。因此，mRNA的瞬时表达是重组酶表达的理想方法。

常用的重组酶之一是Cre重组酶。我们CleanCap ® NLS-Cre重组酶基因是一个上限（第1章）和聚腺苷酸化信使RNA，编码Cre重组酶融合到核定位序列（NLS）。Cre重组酶是衍生自P1噬菌体的酪氨酸重组酶。Cre催化两个loxP位点之间的重组，这些位点由一个34个碱基对的识别位点（5'ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT 3'）组成。Cre重组酶已被广泛用于操纵植物，细菌，酵母和哺乳动物中的DNA。根据loxP位点的方向，Cre可用于诱导DNA盒交换，切除/插入，倒位和易位。

NLS-Cre重组酶mRNA的应用包括创建敲除或敲入动物，组织特异性蛋白表达以及标记研究，这些研究报道了将mRNA递送至给定细胞类型。Cre重组酶mRNA也是评估体外和体内 mRNA递送效力的有用工具。

人才

转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）已经成为锌指核酸酶（ZFN）的一种更容易获得的替代物。像ZFN一样，TALENs利用模块化的DNA结合基序，可以对其进行修饰以引入新的DNA结合特异性。与ZFN不同，TALEN不太容易使从头设计复杂化的序列上下文效应，使它们成为普通科学界更实用的工具。TriLink自定义mRNA转录服务包括TALEN mRNA。TALEN由多个重复可变双残基（RVD）组成，每个重复残基与单个核苷酸结合。通过以特定顺序将RVD串在一起制成TALEN阵列，以提供对新型DNA序列的特异性和结合亲和力。通常，工程化的TALEN序列与非特异性切割结构域融合，例如FokI。与ZFN一样，TALEN充当与相邻DNA序列结合的对。TriLink提供了mRNA表达载体，旨在轻松接受使用Golden Gate方法克隆的TALEN。

转座酶

转座酶是一种以非常准确的方式催化转座子（DNA元件）从基因组中的一个位置移动到另一位置的酶。转座子广泛存在于人类基因组中，并可能导致多达40％的基因组重排。转座酶是将外源序列插入靶基因组的早可用工具之一。通常，用于转移的序列在转座子盒中侧接反向末端重复序列。当转座子盒与转座酶mRNA共转染时，转座酶催化转座子的切除及其插入细胞染色体中。两种常见的转座酶/转座子系统是Sleeping Beauty和PiggyBac。睡美人转座子整合到基因组的TA序列中，