为了让细胞培养更简单、更经济、更，美国FiberCell Systems公司十余年来一直致力于中空纤维细胞培养系统的开发。如今，这种与众不同的培养系统已经上市了。

      FiberCell中空纤维细胞培养系统模拟了生物体循环系统中毛纤维的结构及功能，将天然亲水聚合物，拉成两端有开口的纤维。将此种中空纤维装入柱状的 塑胶容器中，其成品就像光纤排列在电缆中一样。它利用中空纤维膜隔离细胞与细胞培养基，在中空纤维的外壁培养细胞。

空纤维是一种很小的、圆柱形的透滤材料，形状类似于喝水用的吸管，并且直径只有200 μm。这些纤维被装入圆筒外壳中，这样，经圆筒末端泵入的细胞培养基就会流过纤维内部。同时，细胞生长在纤维外侧。于是，这些纤维就创造了一个半通透的屏 障，让葡萄糖和乳酸这样的小分子可以随意地穿过纤维，而蛋白质这样的较大分子则不能穿过。如果有细胞因子或自分泌因子存在，则可以通过选择纤维的孔径或者 截留分子量（MWCO）来控制不同因素对细胞生长的影响。

中空纤维生物反应器和其它细胞培养技术的一个主要区别在于：中空纤维能形成易于细胞附着的多孔渗滤支撑，zui类似于活体内的细胞生长方式。由于营养输送是由下至上的，因此细胞很容易彼此堆积，形成一个具有多层细胞的层面。在中空纤维生物反应器上，细胞传代是不必要的。

中空纤维生物反应器的另一个特点是培养的细胞浓度可以超过108/mL，而一般的旋转烧 瓶培养的哺乳动物细胞浓度大约是106/mL。高浓度细胞可以产生高浓度分泌蛋白，并能快速开展病毒和寄生虫感染，还可以减少细胞对血清的需求甚至使细胞 在无血清培养基中生长。因此，FiberCell中空纤维细胞培养系统是生产10 mg至1 g重组蛋白的。

这一新型培养系统适用于单克隆抗体生产、重组蛋白生产、内皮细胞培养、淋巴细胞培养、体外毒理学研究和病毒载体生产。

FiberCell目前提供三种类型的纤维：聚砜、纤维素和PS+纤维。同时他们还提供三种不同的截留分子量：5 kd、20 kd和0.1微米。

亲水性的聚砜纤维是特别为良好的细胞培养性能而设计的。5 kd MWCO和20 kd MWCO纤维的过滤率较纤维素纤维要高出10倍，便于快速的营养物和废物交换。任何可粘附在塑料表面或悬浮培养的细胞类型都能在聚砜纤维培养圆筒中很好地 生长。纤维素纤维一般不适用于细胞培养，因为它们的低过滤率对细胞生长并非*，它们主要应用在体外毒理学研究上。PS+纤维的性能*，它让蛋白基质、 抗体和细胞因子能与纤维表面结合。因此，这种纤维适合原代细胞类型，您可以控制与细胞相互作用的表面基质，而内皮细胞可在纤维内部生长。

这种操作简便，耗材用量少，产量高，是大规模培养细胞的新选择。

上海金畔生物科技有限公司

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在血液或体液内除Ig分子外，还发现另一族参予免疫效应的大分子，称为补体分子。发现在新鲜免疫血清内加入相应细菌，无论进行体内或体外实验，均证明可以将细菌溶解，将这种现象称之为免疫溶菌现象。如将免疫血清加热60°C30分钟则可丧失溶菌能力。进一步证明免疫血清中含有二种物质与溶菌现象有关，即对热稳定的组分称为杀菌素，即抗体（complement，C）。其后又证实了抗各种动物红细胞的抗体加入补体成分亦可引起红细胞的溶解现象。自此建立了早期的补体概念。即补体为正常血清中的单一组分，它可被抗原与抗体形成的复合物所活化，产生溶菌和溶细胞现象。而单独的抗体或补体均不能引起细胞溶解现象。

补体系统 – 组分

补体系统

由于蛋白质化学和免疫化学技术的进步，自血液中分离、纯化补体成分成功，

已证明补体是单一成分的论点是不正确的，它是由三组球蛋白大分子组成。即*组分是由9种补体成分组成，分别命名为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9。其中C1是由三个亚单位组成，命名为Clq、Clr、Cls，因此*组分是由11种球蛋白大分子组成。发现一些新的血清因子参予补体活化，但它们不是经过抗原抗体复合物的活化途径。而是通过旁路活化途径。这此些因子包括B因子、D因P因子，它们构成补体的第二组分。其后又发现多种参矛控制补体活化的抑制因子或灭活因子，如CI抑制物、I因子、H因子、C4结合蛋白、过敏毒素灭活因子等。这些因子可控制补体分子的活化，对维持补体在体内的平衡起调节作用，它们构成了补体的第三组分。

由于补体活化另一途径的深入研究，对补体系统的生物学意义有了新的识别，从而打破了对补体的传统观点，建立了新的概念。即补体系统是由将近20多种血清蛋白组成的多分子系统，具有酶的活性和自我调节作用。它至少有二种不同的活化途径，其生物学意义不仅是抗体分子的辅助或增强因子，也具有独立的生物学作用，对机体的防御功能、免疫系统功能的调节以及免疫病理过程都发挥重要作用。

1968年世界卫生组织（WHO）的补体命名委员会对补体进行了统一命名。分别以C1-C9命名，1981年对新发现的一些成分和因子也进行了统一命名。每一补体的肽链结构用希腊字母表示，如C3a和β链等。每一分子的酶解断片可用小写英文字母表示如C3a和C3b等酶解断片，具有酶活性分子可在其上画横线表示之，如C1为无酶活性分子，而C1为有酶活性分子。对具有酶活性的复合物则应用其断片表示，如C3转化酶可用C4B，2a表示。

补体分子是分别由肝细胞、巨噬细胞以及肠粘膜上皮细胞等多种细胞产生的。其理化性质及其在血清中的含量差异甚大。全部补体分子的化学组成均为多糖蛋白，各补体成分的分子量变动范围很大，其中C4结合蛋白的分子量zui大，为55万，D因子分子量zui小仅为2.3万。大多数补体成分的电泳迁移率属β球蛋白，少数属a球蛋白及γ球蛋白。血清中补体蛋白约占总球蛋白的10%，其中含量zui高的为C3，约含1mg/ml，而D因子仅含1μg/ml，二者相差约千倍。人类某些疾病其总补含量或单一成分含量可发生变化，因而对体液中补体水平的测定，或组织内补体定位观察，对一些疾病的诊断具有一定意义。

补体系统 – 类型

经典激活（classicalpathway）补体在溶菌或溶血反应时被激活的过程中，11种成分可分为3个功能单位，即①识别单

位：包括C1q、C1r、C1s；②活化单位：包括C2、C3、C4，③膜攻击单位：包括C5、C6、C7、C8和C9。同一功能单位的补体成分彼此间有化学亲和性，激活后可相互结合在一起，共同执行使细胞溶解这一生物学功能。因此，补体的经典激活途径可分为识别、活化和膜攻击3个阶段。这3个阶段一般在靶细胞膜的3个不同部位进行。补体在激活过程中C2、C3、C4、C5均分别裂

解成2个或2个以上的片段，分别标以a、b等符号，如 C3a、C3b、C3c等。其中C2a、C3b、C4b、C5b直接或间接结合在靶细胞上，以固相的形式参与溶细胞过程，C3a、C游离在液相。补体在激活过程中， C5、C6、C7经活化后还可聚合成 C567．并与C3a、C一金畔挥特殊的生物学功能。（图1）

替代激活

替代激活途径（alternative pathway）是直接由C3开始的补体激活途径。此途径既不需要抗原-抗体复合物，也不需激活C1、C2和C4。由于早年认为备解素是替代激活途径的主要成分，所以也称为备解素途径。参与替代激活途径的成分有多种（图2）。

凝集素激活

凝集素激活途径（lectin pathway）是由炎症期产生的蛋白与病原体结合启动激活,同旁路激活途径（alternative pathway）一样，无需依赖抗体（antibody independent）。与旁路途经不同的是，虽不需激活C1(即与抗体FC位点结合形成C1qr2s2），但与经典途径一样，仍需进行C2和C4的激活，再进行C3（即C4b2a3b）。

补体系统 – 激活途径

补体系统各成分通常多以非活性状态存在于血浆之中，当其被激活物质活化之后， 才表现出各种生物学活性。补体系统的激活可以从C1开始；也可以越过C1、C2、C4，从C3开始。前一种激活途径称为经典途径（classical pathway），或传统途径。“经典”，“传统”只是意味着人们早年从抗原体复合物激活补体的过程来研究补体激活的机制时，发现补体系统是从C1开始激活的连锁反应。从种系发生角度而言，旁路途径是更为古老的、原始的激活途径。从同一个体而言，在尚未形成获得性免疫，即未产生抗体之前，经旁路途径激活补体，即可直接作用于入侵的微生物等异物，作为非特异性免疫而发挥效应。由于对旁路途径的认识，远远晚在经典之后，加上人们先入为主观念，造成了命名的不合理。

经典途径

参与补体经典激活途径的成分包括C1-C9。按其在激活过程中的作用，人为地分成三组，即识别单位（Clq、Clr、Cls）、活化单位（C4、C2、C3）和膜攻击单位（C5-C9），分别在激活的不同阶段即识别阶段、活化阶段和膜功击阶段中发挥作用。

（一）识别阶段

Clq：Clq分子有6个能与免疫球蛋白分子上的补体结合点相结合的部位。当两个以上的结合部位与免疫球蛋白分子结合时，即Clq桥联免疫球蛋白之后，才能激活后续的补体各成分IgG为单体，只有当其与抗原结合时，才能使两个以上的IgG分子相互靠拢，提供两个以上相邻的补体结合点不能与Clq接触，只有当IgM与抗原结合，发生构型改变，暴露出补体结合部位之后，才能与Clq结合。一个分子的IgM激活补体的能力大于IgG。Clq与补体结合点桥联后，其构型发生改变，导致Clr和Cls的相继活化。

Clr:Clr在C1大分子中起着连接Clq和Cls的作用。Clq启动后可引起Clr构型的改变，在活性的Clr,后者可使Cls活化。

Cls:Clr使Cls的肽链裂解，其中一个片段Cls具有酯酶活化，即CI的活性。此酶活性可被C1INH灭活。

在经典途径中，一旦形成Cls，即完成识别阶段，并进入活化阶段。

（二）活化阶段

CI作用于后续的补体成分，至形成C3转化酶（C42）和C5转化酶（C423）的阶段。

C4：C4是CI的底物。在Mg2 存在下，CI使C4裂解为C4a和C4b两个片段，并使被结合的C4b迅速失去结合能力。CI与C4反应之后能更好地显露出CI作用于C2的酶活性部位。

C2：C2虽然也是CI的底物，但CI先在C4作用之后明显增强了与C2的相互作用。C2在Mg2 存在下被CI裂解为两个片段C2a和C2b。当C4b与C2a结合成C4b2b(简写成C42)即为经典途径的C3转化酶。

C3：C3被C3转化酶裂解在C3a和C3b两个片段，分子内部的疏酯基（-S-CO-）外露，成为不稳定的结合部位。硫酯基经加水分解，成为-SH和-COOH也可与细菌或细胞表面的-NH2和-OH反应而共价结合。因此，C3b通过不稳定的结合部位，结合到抗原抗体复合物上或结合到C42激活C3所在部位附近的微生物、高分子物质及细胞膜上。这点，对于介导调理作用和免疫粘附作用具有重要意义。C3b的另一端是个稳定的结合部位。C3b通过此部位与具有C3b受体的细胞相结合。C3b可被I因子灭活。C3a留在液相中，具有过敏毒素活性，可被羟肽酶B灭活。

（三）膜攻击阶段

C5转化酶裂解C5后，继而作用于后续的其他补体成分，zui终导致细胞受损、细胞裂解的阶段。

C5：C5转化酶裂解C5产生出C和C5b两个片段。C游离于液相中，具有过敏毒素活性和趋化活性。C5b可吸附于邻近的细胞表面，但其活性极不稳定，易于衰变成C5bi。

C6-C9：C5b虽不稳定，当其与C6结合成C56复合物则较为稳定，但此C5b6并无活性。C5b6与C7结合成三分子的复合物C5b67时，较稳定，不易从细胞膜上解离。

C5b67即可吸附于已致敏的细胞膜上，也可吸附在邻近的，未经致敏的细胞膜上（即未结合有抗体的细胞膜上）。C5b67是使细胞膜受损伤的一个关键组分。它与细胞膜结合后，即插入膜的磷脂双层结构中。

若C5b67未与适当的细胞膜结合，则其中的C5b仍可衰变，失去与细胞膜结合和裂解细胞的活性。

C5b67虽无酶活性，但其分子排列方式有利于吸附C8形成C5678。其中C8是C9的结合部位，因此继续形成C5-9，即补体的膜攻击单位，可使细胞膜穿孔受损。

-不C5b、C6、C7结合到细胞膜下是细胞膜仍完整无损；只有在吸附C8之后才出现轻微的损伤，细胞内容物开始渗漏。在结合C9以后才加速细胞膜的损伤过程，因而认为C9是C8的促进因子。

旁路途径

旁路激活途径与经典激活途径不同之处在于激活是越过了C1、C4、C2三种成分，直接激活C3继而完成C5至C9各成分的连锁反应，还在于激活物质并非抗原抗体复合物而是细菌的细胞壁成分—脂多糖，以及多糖、肽聚糖、磷壁酸和凝聚的IgA和IgG4等物质。旁路激活途径在细菌性感染早期，尚未产生特异性抗体时，即可发挥重要的抗感染作用。

（一）生理情况下的准备阶段

在正常生理情况下，C3与B因子、D因子等相互作用，可产生极少量的C3B和C3bBb（旁路途径的C3转化酶），但迅速受H因子和I因子的作用，不再能激活C3和后续的补体成分。只有当H因子和I因子的作用被阻挡之际，旁路途径方得以激活。

C3：血浆中的C3可自然地、缓慢地裂解，持续产生少量的C3b，释入液相中的C3b迅速被I因子灭活。

B因子：液相中缓慢产生的C3b在Mg2 存在下，可与B因子结合形成C3Bb。

D因子：体液中同时存在着无活性的D因子和有活性的D因子（B因子转化酶）。D因子作用于C3bB，可使此复合物中的B因子裂解，形成C3bBb和Ba游离于液相中。C3bBb可使C3裂解为C3a和C3b，但烊际上此酶效率不高亦不稳定，H因子可置换C3bBb复合物中的Bb,使C3b与Bb解离，解离或游离的C3b立即被I因子灭活。因此，在无激活物质存在的生理情况下，C3bBb保持在极低的水平，不能大量裂解C3，也不能激活后续补体成分。但是这种C3的低速度裂解和低浓度C3bBb的形成，具有重大意义。可比喻为处于“箭在弦上，一触即发”的状态。

(二)旁路途径的激活

旁路途径的激活在于激活物质（例如细菌脂多糖、肽聚糖；病素感染细胞、肿瘤细胞，痢疾阿米巴原虫等）的出现。激活物质的存在为C3b或C3bBb提供不易受H因子置换Bb，不受Ⅰ因子灭活C3b的一种保护性微环境，使旁路激活途径从和缓进行的准备阶段过渡到激活的阶段。

（三）激活效应的扩大

C3在两条激活途径中都占据着重要的地位。C4是血清中含量zui多的补体成分，这也正是适应其作用之所需。不论在经典途径还是在旁路途径，当C3被激活物质激活时，其裂解产物C3b又可在B因子和D因子的参与作用下合成新的C3bBb。后者又进一步使C3裂解。由于血浆中有丰富的C3，又有足够的B因子和Mg2 ，因此这一过程一旦被触发。就可能激活的产生显着的扩大效应。有人称此为依赖C3Bb的正反馈途径，或称C3b的正反馈途径。

补体的两条激活途径有共同之处，又有各自的特点。在补体激活过程中，两条途径都是补体各成分的连锁反应，许多成分在相继活化后被裂解成一大一小两个片段；不同的片段或片段的复合物可在靶细胞表面向前移动，如C42，C423，C5b，C567，虽亦可原始的激活部位就地形成复合物，但仍以移动为主，在激活过程中，补体成分和（或）其裂解产物组成更大的复合物，同时又都在扩大其激活效应，这一过程可形象地比喻为“滚雪球”。l实际两条途径相互作用，发挥协同作用，增加补体系统对机体的保护，过激后成为免疫过激（也就是过敏反应），造成对机体的损害。

补体系统 – 理化性质

补体系统中各成分的理化性状，补体成分大多是β球蛋白，少数几种属a或γ球蛋白，分子量在25～390KD之间。在血清中的含量以C3为zui高，达1300μg/ml，其次为C4、S蛋白和H因子，各约为C3含量的1/3；其他成分的含量仅为C3的1/10或更低。

补体系统 – 补体受体

补体成分激活后产生的裂解片段，能与免疫细胞表面的特异性受体结合。

这对于补体发挥其生物学活性具有重要意义。

补体受体(complementruceptor，CR)曾按其所结合配体而命名为C3b受体、C3d受体等；但经详细研究后发现，补体受体并非仅与C3裂解产物反应，因而按其发现先后依次命名为CR1（CD35），CR2（CD21），CR3（CD11b/CD18），CR4(gp150，90：CD11c/CD18)。其主要特征列于表3-5。此外，尚有其他补体成分的受体，如Ciq受体、C3a受体、C受体等。因对其了解不够清楚，不拟介绍。

一、CR1（CD35）

CR1作为免疫粘附(immuneadherent，IA)受体而引起免疫粘附现象早已熟知。此受体也称为C3b受体或C3b/C4b受体。据报道，红细胞上的CR1数约为50-1400个/细胞，其数目显着少于B细胞和吞噬细胞，但体内90%的CR1却存于红细胞上。

提纯的CR1为分子量约200kD的糖蛋白，但后来发现它有4种分子量不同的同种异型。Wong等（1986）已经阐明，分子量的差异是由于基因不同所致。

CR1的免疫功能可能有以下几方面：①中性粒细胞和单核-巨噬细胞上的CR1，可与结合在细菌或病毒上的C3b结合，促进吞噬细胞的吞噬作用；②促进两条激活途径中的C3转化酶（C42），C3bBb）的激活；③作为I因子的辅助因子，促使C3b和C4b灭活；④红细胞上的CR1可与被调理（结合有C3b）的细胞、病毒或免疫复合物等结合，以便运送到肝、脾进行处理，SLE病人免疫复合物量明显增多，其红细胞膜上的CR1在体内有运送免疫复合物的作用；⑤B淋巴细胞膜上的CR1与CR2协同作用下，可促使B细胞活化。

二、CR2（CD21）

CR2旧称C3d受体，已经证明，它是B细胞上的EB病毒受体。CR2配体按其亲和性的高低程度依次为C3dg、C3d、Ic3b。C3b亲和性虽低，但亦可与其反应。

CR2的免疫功能尚未阐明清楚，但实验表明，当加入CR2配体时可使B细胞活化。据此推想，在抗体的二次应答中它也许会想某种作用，即借结合在抗原复合物上的C3裂解产物，引起针对该抗原的二次抗体应答。

三、CR3（CD11b/CD18）

CR3亦称为Ic3b受体，CR3的配体是iC3b,但CR1、CR2、也和iC3b反应。CR3与配体结合时尚需有二价离子存在，为其特点。

CR3是由分子量165kD的α链（CD11b）和95kD的β链(CD18)非共价结合的糖蛋白，识别此分子的单克隆抗体有Mac-1和Mo-1等。CR3与CR4（CD11C/CD18）有共同的β链，因此其功能也多有相似之处，白细胞粘附缺陷病（leucocyteadhesion deficiency）病人缺乏这种共同的β链。病人的中性粒细胞虽正常，但不能停留在感染的部位，因此病人易反复遭受感染。这表明CR3和CR4均与吞噬功能密切相关。

四、CR4（gp150/95，CD11c/CD18）

中性粒细胞和单核-巨噬细胞高度表达本受体。其配体为iC3b，但针对其他补体受体的单克隆抗体不能阻断CR4与iC3b的结合，证明CR4的存在。CR4与gp150/95为同一分子，对其功能尚有诸多不明之处。据认为CR4在排除组织内与iC3b的结合的颗粒上起作用。它和CR3一样，与配体结合需有二价离子的存在。CR3很可能在机体防御上有重要作用。

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Table 3—Pichia expression kit components.

EasySelect™ Pichia

Expression Kit

Multi-Copy Pichia

Expression Kit

Original Pichia

Expression Kit

Vectors

pPICZ A, B, C 

（20 µg each）

pPICZα A, B, C 

（20 µg each）

pPIC9K （20 µg）

pPIC3.5K （20 µg）

pAO815 （20 µg）

pPIC9 （10 µg） 

pPIC3.5 （10 µg）

pHIL-D2 （10 µg）

pHIL-S1 （10 µg）

Strains

X-33 （Mut+

, His+

）

GS115 （Mut+

）

KM71 （MutS

）

GS115/pPICZ/lacZ 

（control）

GS115 （Mut+

）

KM71 （MutS

）

GS115/β-gal （control）

GS115/albumin （control）

GS115 （Mut+

）

KM71 （MutS

）

GS115/β-gal （control）

GS115/albumin （control）

Transformation 

reagents

Pichia EasyComp™ Kit

（120 transformations）

Spheroplast Module

（50 transformations）

Spheroplast Module

（50 transformations）

Sequencing

primers

5´ AOX1

3´ AOX1

α-factor

5´ AOX1

3´ AOX1

α-factor

5´ AOX1

3´ AOX1

α-factor

Media and 

supplements

YP base medium 

 （2 pouches）*

YP base agar 

 （2 pouches）*

Yeast Nitrogen Base 

 （1 pouch）†

 Zeocin™ （250 mg）

YP base medium 

 （2 pouches）*

YP base agar

 （2 pouches）*

Yeast Nitrogen Base 

 （1 pouch）†

YP base medium 

 （2 pouches）*

YP base agar

 （2 pouches）*

Yeast Nitrogen Base

 （1 pouch）†