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biogrammatics毕赤酵母产品列表

发表于由

 

BioGrammatics，Inc.成立于2008年，其重点是通过产生创新工具来扩大巴斯德毕赤酵母作为蛋白质表达系统的用途，并在表达菌株开发的各个层面为客户提供支持。

在任何一天，我们都会为客户运送载体或菌株以构建自己的表达系统，分析我们为客户创建的菌株的蛋白质表达谱，或生成毕赤酵母基因组序列或转录组以支持法规提交。

biogrammatics毕赤酵母产品列表

 

 

J

EV 10100

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或自定义分泌信号。

pJAG（预切）

EV 10101

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或自定义分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

pJAG-s1

EV 10110

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的完整  酿酒酵母 α交配因子的前促分泌信号。

 

pJAG-s1（预切）

EV 10111

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的完整  酿酒酵母 α交配因子的前促分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

pJAH-s2

EV 30120

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含一个截短的  酿酒酵母 α交配因子预分泌信号，用于细胞外表达。

 

pJAH-s2（预切）

EV 30121

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含一个截短的  酿酒酵母 α交配因子预分泌信号，用于细胞外表达。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

pJAG-s3

EV 10130

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的Ost1p /α交配因子融合分泌信号。

 

pJAG-s3（预切）

EV 10131

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的Ost1p /α交配因子融合分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

pJAG-s5

EV 10150

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含  用于细胞外表达的酿酒酵母 Aga2p信号序列。

pJAG-s5（预切）

EV 10151

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含  用于细胞外表达的酿酒酵母 Aga2p信号序列。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

J

EV 10200

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或自定义分泌信号。

pJUG（预切）

EV 10201

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或自定义分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

pJUG-s1

EV 10210

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的完整  酿酒酵母 α交配因子的前促分泌信号。

pJUG-s1（预切）

EV 10211

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的完整  酿酒酵母 α交配因子的前促分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

pJUG-s2

EV 10220

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含一个截短的  酿酒酵母 α交配因子预分泌信号，用于细胞外表达。

 

pJUG-s2（预切）

EV 10221

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含一个截短的  酿酒酵母 α交配因子预分泌信号，用于细胞外表达。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

简

EV 20100

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或与您自己的自定义分泌信号一起使用。

 

pJAN（预切）

EV 20101

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或自定义分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

pJAN-s1

EV 20110

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的完整  酿酒酵母 α交配因子的前促分泌信号。

 

pJAN-s1（预切）

EV 20111

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的完整  酿酒酵母 α交配因子的前促分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

pJAN-s2

EV 20120

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含一个截短的  酿酒酵母 α交配因子预分泌信号，用于细胞外表达。

 

 

pJAN-s2（预切）

EV 20121

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含一个截短的  酿酒酵母 α交配因子预分泌信号，用于细胞外表达。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

pJAN-s3

EV 20130

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的Ost1p /α交配因子融合分泌信号。

 

pJAN-s3（预切）

EV 20131

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的Ost1p /α交配因子融合分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

pJAN-s4

EV 20140

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含 用于细胞外表达的 酿酒酵母 Ost1p信号序列。

 

pJAN-s4（预切）

EV 20141

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含   用于细胞外表达的酿酒酵母 Ost1p信号序列。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

pJAN-s5

EV 20150

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含  用于细胞外表达的酿酒酵母 Aga2p信号序列。

 

pJAN-s5（预切）

EV 20151

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含  用于细胞外表达的酿酒酵母 Aga2p信号序列。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

J

EV 20200

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或自定义分泌信号。

 

 

pJUN（预切）

EV 20201

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体不含分泌信号，可用于细胞内表达或自定义分泌信号。

 

使用Bsa I线性化，可直接与GibsonAssembly®，NEBuilder®或NEB®Golden Gate克隆技术一起使用。

 

pJUN-s1

EV 20210

Snapgene文件

用于整合到毕赤酵母基因组中的载体。

 

载体包含用于细胞外表达的完整  酿酒酵母 α交配因子的前促分泌信号。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BioGrammatics糖基化毕赤酵母表达体系

发表于由

 

 

 

BioGrammatics—糖基化毕赤酵母表达体系

Pichia酵母菌属的巴斯德毕赤酵母是当今常用的单细胞真核表达体系，是载体构建、表达、发酵和纯化重组蛋白和肽的优良体系。BioGrammatics在毕赤酵母的生命科学研究利用领域有着悠久的历史和丰富的经验，通过与Research Corporation Technologies（RCT）合作开发出GlycoSwitch®技术，利用该技术可以在毕赤酵母中表达的蛋白加以改性糖基化修饰。糖基化可影响蛋白质折叠，稳定性和蛋白质 – 蛋白质相互作用，因此利用GlycoSwitch®技术可设计具有更多“人类”糖基化特征的蛋白质，用以研发适用于人类的的生物药物，以及改良常规重组蛋白质。目前BioGrammatics可提供的基于毕赤酵母的产品包括快速简单的蛋白质表达、分子表达工具下的菌株设计（如强大的严格调控的启动子，的分泌基因组操作）、大规模高细胞密度酵母发酵（> 700 g / l wcw，200k升）、特定的酵母发酵条件设计、真核蛋白质加工（折叠，分泌，糖基化）及酵母遗传学分析等服务。

SuperMan5 (his—)

Description:

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures (histidine auxotroph)

描述：

GlycoSwitch ®应变，曼5 N-连接的寡糖的结构（组氨酸营养缺陷型）

 

 

SuperMan5（his-），Och1-破坏与pGAP-甘露糖苷酶表达盒，杀稻瘟素抗性）。GS115（his4-），来自里氏木霉的α1,2-甘露糖苷酶，由具有杀稻瘟素抗性基因的质粒上的GAP启动子调节，破坏SuperMan5基因组中的Och1基因。

Catalog Number

Description

Units

Price

PS005-01

Pichia pastoris strain as YPD agar culture stab

1 stab

$400.00

 

PS005-02

Pichia pastoris strain as electrocompetent cells

5 transformations

$350.00

 

BioGrammatics公司产品：

一、毕赤酵母表达载体

重组蛋白在毕赤酵母中的表达常见于表达载体整合到毕赤酵母基因组中，基因组整合导致目的基因在毕赤酵母中稳定表达。通过大规模的表达菌株发酵可生产大量的目的蛋白质。基于目的蛋白和基因的自身特异性，在载体设计时需要考虑以下因素：1）胞内表达或者分泌表达；2）适宜的启动子（诱导型，组成型，强，弱）；3）选择标记；4）特定基因/ （开放阅读框）ORF序列；5）表达盒在毕赤酵母基因组中适的位置。

BioGrammatics在毕赤酵母表达载体研究领域拥有丰富的经验，创建并测试了大量的表达载体，以优化数百种基因的表达和用于特定的应用，包括细胞内和细胞外表达，膜蛋白的表达，高水平蛋白质生产以及蛋白质在代谢途径中的表达和支持重组蛋白质产物宜加工程度的蛋白质。

BioGrammatics采用的pJ载体（pJ – vectors, Jeannies vectors)是4-5kb的质粒，带有氨苄青霉素筛选基因和“无缝”克隆方案。克隆方案基于在其识别序列之外切割的IIS型限制酶，因此，可在终表达载体中去除限制酶结合位点，并且可以在不多加入不需要的密码子的情况下加入ORF。

Product

Description

pJAN–s1

extracellular expression vector, S. cerevisiae α mating factor leader,

nourseothricin selection

pJAZ–s1

extracellular expression vector, S. cerevisiae α mating factor leader,

 zeocin selection

pJAG–s1

extracellular expression vector, S. cerevisiae α mating factor leader,

 G418 selection

pJAN

intracellular expression vector, nourseothricin selection

pJAZ

intracellular expression vector, zeocin selection

pJAG

intracellular expression vector, G418 selection

 

二、毕赤酵母表达菌株

BioGrammatics提供BG和GlycoSwitch®菌株两种毕赤酵母表达菌株系列。其中BG菌株来源于野生巴斯德毕赤酵母菌株，初于1940年由加利福尼亚的Herman Phaff分离。我们使用Illumina HiSeq技术对Phaff菌株进行单菌落分离，成为BioGrammatics起始的原始菌株BG08，BG08在经过改良以消除细胞质杀伤质粒的能力产生野生型表达菌株BG10。此后除了BG09之外，BG系列中的所有后续菌株均通过的BG10基因组操作衍生而来。 而BG09是BG08的一个特定变体，已开发用于在特定的胰蛋白酶切割位点标记13C同位素后进行质谱分析。

除BG系列外，BioGrammatics还是RCT的GlycoSwitch®菌株经销商。 GlycoSwitch®菌株系列源于20世纪70年代的巴斯德毕赤酵母GS115菌株，是Phaff菌株的突变分离株之一，选择用于组氨酸营养缺陷型培养。初的GlycoSwitch®Man5菌株来源于比利时根特大学和法兰德斯生物技术研究所（VIB）的Roland Contreras博士，Nico Callewaert博士及其同事的合作分离。 SuperMan5菌株是由BioGrammatics研发的GlycoSwitch®Man5的后续修饰菌株，其突变体och1基因座的所有同源性区域基因已被去除以防止其通过同源重组而逆转为野生型。

Product

Description

Pichia pastoris SuperMan5 strain (HIS+)

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures

Pichia pastoris SuperMan5 strain (his—)

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures (histidine auxotroph)

Pichia pastoris BG10 strain

Wild type Pichia pastoris expression strain (killer plasmid free)

Pichia pastoris BG11 strain

Derivative of Pichia pastoris BG10 strain, aox1Δ, MutS (methanol utilization slow)

Pichia pastoris BG09 strain

Derivative of Pichia pastoris BG08 strain, arg4Δ::nourseothricinR, lys2Δ::hygromycinR(arginine, lysine auxotroph)

Pichia pastoris BG12 strain

Derivative of Pichia pastoris BG10 strain, his4Δ (histidine auxotroph)

Pichia pastoris SuperMan5 strain (HIS+, pep4Δ)

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures (PEP4 protease deletion)

 

 

 

 

三、具有修饰糖基化的毕赤酵母菌株 – GlycoSwitch®技术。

GlycoSwitch系列菌株是与BioGrammatics与Research Corporation Technologies（RCT）合作，提供个可进行糖基化修饰的毕赤酵母表达载体。糖基化可影响蛋白质折叠，稳定性和蛋白质 – 蛋白质相互作用，因可用于设计生成具有更多“人类”糖基化的蛋白质和生物制药，以及改良其他类别的重组蛋白质。其核心GlycoSwitch®菌株具有中心聚糖加工酶（OCH1），可阻止聚糖延伸，并表达外源甘露糖苷酶以将现有聚糖修剪成更均匀的Man5结构。此外，BioGrammatics还可提供基于GlycoSwitch®技术的定制化研发合同服务，使用BioGrammatics公司的丰富的Pichia专业技术为客户提供特定应用的量身定制糖蛋白。

Product

Description

Pichia pastoris SuperMan5 strain (HIS+)

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures

Pichia pastoris SuperMan5 strain (his—)

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures (histidine auxotroph)

GlycoSwitch Expression Vector Kit

 

pGlycoSwitch®–GnT–I–HIS

Histidine selection vector for expression of GlcNAc transferase I activity in Pichia pastoris

pGlycoSwitch®–ManII/1

G418 selection vector for expression of Mannosidase II activity in Pichia pastoris

pGlycoSwitch®–GnT–II

Hygromycin selection vector for expression of GlcNAc transferase II activity in Pichia pastoris

pGlycoSwitch®–GalT/1

Nourseothricin selection vector for expression of Gal transferase I activity in Pichia pastoris

Pichia pastoris  SuperMan5 strain (HIS+, pep4Δ)

GlycoSwitch® strain, Man5 N-linked oligosaccharide structures (PEP4 protease deletion)

pGlycoSwitch®–GnT–I

Zeocin selection vector for expression of GlcNAc transferase I activity in Pichia pastoris

 

四、毕赤酵母表达系统培养基

该系列产品于毕赤酵母表发体系发酵培养或扩增，包括干粉和浓缩液，用于配制100ml和2.5L的培养液。

货号

类    型

规 格

PD001-100

1 g/ml stock solution, prepares 2.5 liters of YPD-nourseothricin plates

100 mg

PM001-100

pouch of powdered medium, prepares 100 ml

1 pouch

PM001-500

pouch of powdered medium, prepares 500 ml

1 pouch

 

 

上海金畔生物科技有限公司是实验试剂一站式采购服务商

1：强大的进口辐射能力，血清、抗体、耗材、大部分限制进口品等。

2：产品种类齐全，经营超过700多品牌，基本涵盖所有生物实验试剂耗材。

3：提供加急服务，货品一般1-2周到货。

4：富有竞争力的价格优势，绝大部分价格有优势。

5：多年积累良好的信誉，大部分客户提供货到付款服务。客户包括清华、北大、交大、复旦、中山等100多所高校，ROCHE，阿斯利康、国药、fisher等知药企。

6：我们还是Santa,Advanced Biotechnologies Inc,Athens Research & Technology,bangs,BBInternational,crystalchem,dianova,FD Neurotechnologies,Inc. FormuMax Scientific,Inc, Genebridege, Glycotope Biotechnology GmbH; iduron,Innovative Research of America, Ludger, neuroprobe,omicronbio, Polysciences,prospecbi, QA-BIO,quickzyme,RESEARCH DIETS,INC,sterlitech；sysy,TriLink BioTechnologies,Inc；worthington-biochem,zyagen等几十家国外公司代理。

7：我们还是invitrogen,qiagen,MiraiBioam,sigma;neb,roche,merck, rnd,BD, GE,pierce,BioLegend等知*批发，欢迎合作。

 

毕赤酵母宿主细胞DNA残留检测试剂盒 毕赤酵母残留DNA定量分析试剂

发表于由

毕赤酵母宿主细胞DNA残留检测试剂盒 毕赤酵母残留DNA定量分析试剂

产品说明书

FAQ

COA

已发表文献

产品简介

 

毕赤酵母宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中毕赤酵母残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测毕赤酵母细胞的残留DNA，其定量限可以达到3 fg/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

产品信息

 

货号

41328ES50 / 41328ES60

规格

50 T / 100 T

 

组分信息

 

组分编号

组分名称

41328ES50

41328ES60

41328-A

Pichia pastoris qPCR Mix

0.75 mL

1.5 mL

41328-B

Pichia pastoris Primer&Probe Mix

200 μL

400 μL

41328-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4管

41328-D

Pichia pastoris DNA Control (30 ng/μL)

25 μL

50 μL

41328-E

IC*

50 μL

100 μL

*IC：Internal control，内部对照

 

储存条件

 

1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41328-A和41328-B均需避光保存。

2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

 

适用机型

 

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

 

使用说明

 

1. Pichia pastoris DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀释液）将Pichia pastoris DNA Control定量参考品梯度稀释*，稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下：

1）将试剂盒中的Pichia pastoris DNA Control定量参考品和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2）取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Pichia pastoris DNA Control定量参考品，Std0即稀释为3 ng/μL浓度，振荡混匀后低速离心10 sec，该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过3个月）**，使用时避免反复冻融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***，再进行梯度稀释****，具体稀释方法如下：

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

表1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试300 pg/μL~30 fg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2~8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。

****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中Pichia pastoris DNA标准品浓度（以制备加30 pg Pichia pastoris DNA量的ERC为例），具体操作如下：

1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2）加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1）取100 μL样本基质溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液（即15 μL Pichia pastoris qPCR Mix + 4μL Pichia pastoris Primer&Probe Mix + 1 μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

 

5. 反应体系

组分

体积(μL)

Pichia pastoris qPCR Mix*

15

Pichia pastoris Primer&Probe Mix

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

 

表2 标准品反应体系

*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样本TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如10 μL的3 pg/μL标准品DNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下表为参考板位：

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

 

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

 

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

 

 

 

B

NTC

 

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

 

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

 

 

 

C

NTC

 

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

 

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

 

 

 

D

 

 

 

 

 

 

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

 

 

 

E

NCS

 

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

 

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

 

 

 

F

NCS

 

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

 

 

 

 

 

 

 

G

NCS

 

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

 

 

 

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表3 上机参考板位

该示例是对毕赤酵母残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度的毕赤酵母DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2）创建2个检测探针，Target 1命名为“毕赤酵母-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；Target 2命名为“IC”，选择报告荧光基团为“CY5”，猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含义为每孔DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”，参比荧光勾选“ROX”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4）扩增程序设置：设置三步法扩增程序，反应体积30 μL。

循环步骤

温度（℃）

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸（收集荧光）

60℃

30 sec

表4 扩增程序

7. qPCR结果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲：R²＞0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5）根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL) – 样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.pg)×100%。

6）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。

8）待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大，则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本，则优先考虑样本加标回收率结果，IC结果作为参考。

 

Ver.CN20231013

毕赤酵母宿主细胞DNA残留检测试剂盒 毕赤酵母残留DNA定量分析试剂

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产品简介

 

毕赤酵母宿主细胞DNA残留检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中毕赤酵母残留DNA含量的试剂盒。

本试剂盒采用探针法荧光定量PCR原理，可专一快速的检测毕赤酵母细胞的残留DNA，其定量限可以达到3 fg/μL水平。该试剂盒可与本公司的磁珠法残留DNA样本前处理试剂盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。

 

产品信息

 

货号

41328ES50 / 41328ES60

规格

50 T / 100 T

 

组分信息

 

组分编号

组分名称

41328ES50

41328ES60

41328-A

Pichia pastoris qPCR Mix

0.75 mL

1.5 mL

41328-B

Pichia pastoris Primer&Probe Mix

200 μL

400 μL

41328-C

DNA Dilution Buffer

1.8 mL×2管

1.8 mL×4管

41328-D

Pichia pastoris DNA Control (30 ng/μL)

25 μL

50 μL

41328-E

IC*

50 μL

100 μL

*IC：Internal control，内部对照

 

储存条件

 

1. 所有组分均干冰运输，-25~-15℃保存，有效期2年。其中，41328-A和41328-B均需避光保存。

2. 收到货后，请检查共5个组分是否齐全，并立即放入对应的保存温度中储存。

 

注意事项

 

1. 本产品仅作科研用途。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本试剂前请仔细阅读说明书，实验应规范操作，包括样本处理、反应体系的配制及加样。

4. 每个组分在使用前都应充分震荡混匀，低速离心。

 

适用机型

 

包含但不限于以下仪器：

Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；

Bio-Rad：CFX96 Optic Module；

上海宏石医疗科技：SLAN-96S。

 

使用说明

 

1. Pichia pastoris DNA Control定量参考品的稀释和标准曲线的制备

用试剂盒中提供的DNA Dilution Buffer（DNA稀释液）将Pichia pastoris DNA Control定量参考品梯度稀释*，稀释浓度依次为3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL。

具体操作如下：

1）将试剂盒中的Pichia pastoris DNA Control定量参考品和DNA Dilution Buffer置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，低速离心10 sec。

2）取6支洁净的1.5 mL离心管，分别标记为Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。

3）在标记为Std0的1.5 mL离心管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL Pichia pastoris DNA Control定量参考品，Std0即稀释为3 ng/μL浓度，振荡混匀后低速离心10 sec，该浓度可分装置于-25~-15℃短期保存（不超过3个月）**，使用时避免反复冻融。

4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5离心管中先分别加入90 μL DNA Dilution Buffer***，再进行梯度稀释****，具体稀释方法如下：

稀释管

稀释比例

终浓度

Std1

10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 pg/μL

Std2

10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 pg/μL

Std3

10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer

3 pg/μL

Std4

10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer

300 fg/μL

Std5

10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer

30 fg/μL

表1 标准品梯度稀释

*每个浓度做3个复孔，该试剂可测试300 pg/μL~30 fg/μL线性范围。若需要，可适当扩大或缩小线性范围。

**为减少反复冻融次数和避免污染，建议初次使用时将DNA定量参考品分装储存于-25~-15℃。

***已融化未使用的DNA稀释液可保存于2~8℃ 7天，若长时间不用，请放置于-25~-15℃。

****为确保模板完全混匀，每个梯度稀释时需轻微震荡混匀约1 min。

2. 样本加标回收质控ERC的制备

根据需要设置ERC中Pichia pastoris DNA标准品浓度（以制备加30 pg Pichia pastoris DNA量的ERC为例），具体操作如下：

1）取100 μL待测样本加入1.5 mL洁净的离心管中，再加入10 μL Std3，混匀，标记为ERC。

2）加标回收ERC和同批待测样本一起进行样本前处理，制备加标回收ERC纯化液。

3. 阴性抽提质控NCS的制备

根据实验设置阴性抽提质控NCS，具体操作如下：

1）取100 μL样本基质溶液（或DNA稀释液）加入1.5 mL洁净的离心管中，标记为NCS。

2）阴性质控NCS和同批待测样本一起进行样本前处理，制备成阴性质控NCS纯化液。

4. 无模板对照NTC的制备

根据实验设置无模板对照NTC，具体操作如下：

1）无模板对照NTC无需进行样本前处理，在qPCR法检测残留DNA含量阶段开始配置即可。

2）每管或孔中NTC样本为20 μL Mix混合液（即15 μL Pichia pastoris qPCR Mix + 4μL Pichia pastoris Primer&Probe Mix + 1 μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建议配置3个重复孔的量。

 

5. 反应体系

组分

体积(μL)

Pichia pastoris qPCR Mix*

15

Pichia pastoris Primer&Probe Mix

4

IC

1

DNA Template**

10

总体积***

30

 

表2 标准品反应体系

*根据反应孔数计算本次所需Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）× (15+4+1) μL（含有2孔的损失量）。通常，每个样本做3个重复孔。

**反应孔数=（5个浓度梯度的标准曲线+1个无模板对照NTC+1个阴性抽提质控NCS+待测样本TS个数+待测样本对应加标回收ERC个数）× 3。

NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer

NCS (Negative Control Solution)：样本基质溶液或DNA Dilution Buffer进行样本前处理后，所得纯化液为NCS

TS (Test Sample)：待测样本

ERC (Extraction Recovery Control)：待测样本中加入如10 μL的3 pg/μL标准品DNA后进行样本前处理，所得纯化液为加标回收ERC

***加样完成密封好管子后，请低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，再震荡混匀5 sec以上，完全混匀反应液，再低速离心10 sec将管壁的液体离心收集至管底，如有气泡，需将气泡排尽。

下表为参考板位：

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

NTC

 

待测样本TS1

待测样本TS1

待测样本TS1

 

标准曲线Std1

标准曲线Std1

标准曲线Std1

 

 

 

B

NTC

 

待测样本TS2

待测样本TS2

待测样本TS2

 

标准曲线Std2

标准曲线Std2

标准曲线Std2

 

 

 

C

NTC

 

待测样本TS3

待测样本TS3

待测样本TS3

 

标准曲线Std3

标准曲线Std3

标准曲线Std3

 

 

 

D

 

 

 

 

 

 

标准曲线Std4

标准曲线Std4

标准曲线Std4

 

 

 

E

NCS

 

样本加标ERC1

样本加标ERC1

样本加标ERC1

 

标准曲线Std5

标准曲线Std5

标准曲线Std5

 

 

 

F

NCS

 

样本加标ERC2

样本加标ERC2

样本加标ERC2

 

 

 

 

 

 

 

G

NCS

 

样本加标ERC3

样本加标ERC3

样本加标ERC3

 

 

 

 

 

 

 

H

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

表3 上机参考板位

该示例是对毕赤酵母残留DNA qPCR法检测操作的展示，检测样本包括：5个浓度梯度的毕赤酵母DNA标准曲线、1个无模板对照NTC、1个阴性质控NCS、3个待测样本TS、3个加样回收ERC。建议每个样本做3个重复孔。

6. 扩增程序参数设置（两步法）（以ABI公司7500 qPCR仪、软件版本2.0为例）

1）创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2）创建2个检测探针，Target 1命名为“毕赤酵母-DNA”，选择报告荧光基团为“FAM”，猝灭荧光基团为“None”；Target 2命名为“IC”，选择报告荧光基团为“CY5”，猝灭荧光基团为“None”。参比荧光为“ROX”（参比荧光可根据仪器型号等情况，选择是否需要添加）。

3）在“Assign target (s) to the selected wells”面板中，将标准曲线孔的“Task”一栏设置为“Standard”，并且在“Quantity”一栏分别赋值为“300000”、“30000”、“3000”、“300”、“30”（含义为每孔DNA浓度，单位为fg/μL），并且在相应的“Sample Name”一栏命名为“300 pg/μL”、“30 pg/μL”、“3 pg/μL”、“300 fg/μL”、“30 fg/μL”；将无模板对照NTC孔的“Task”一栏设置为“NTC”；将阴性质控NCS孔、待测样本TS孔、样本加标回收ERC孔的“Task”一栏设置为“Unknown”，并且在相应的“Sample Name”一栏中分别命名为“NCS”、“TS”、“ERC”，参比荧光勾选“ROX”，之后点击“Start Run”，开始仪器运行。

4）扩增程序设置：设置三步法扩增程序，反应体积30 μL。

循环步骤

温度（℃）

时间

循环数

预变性

95℃

5 min

1

变性

95℃

15 sec

40

退火/延伸（收集荧光）

60℃

30 sec

表4 扩增程序

7. qPCR结果分析

1）在“Analysis”的“Amplification Plot”面板中，系统会自动给出“Threshold”，有时系统给出的“Threshold”离基线太近，导致复孔之间Ct相差甚远，可手动调节“Threshold”至合适位置，点击“Analyze”。此时可在“Multicomponent Plot”初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2）在“Analysis”的“Standard Curve”面板中，可读取标准曲线的R²、扩增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的标曲：R²＞0.99，扩增效率在90%≤Eff%≤110%范围内，Slope在-3.6~-3.1。

3）在“Analysis”的“View well table”面板中，“Quantity”一栏可读取无模板对照NTC、阴性质控NCS、待测样本TS、样本加标回收ERC的检测值，单位为fg/μL，后续可在检测报告中将单位换算成pg/μL或pg/mL。

4）结果分析的参数设置需依据具体的机型及使用的软件版本，一般也可由仪器自动判读。

5）根据待测样本TS和样本加标回收ERC的检测结果计算加标回收率，加标回收率要求在50%~150%之间。加标回收率计算公式：回收率(%) = {样本加标测定值(eg.pg/µL) – 样本测定值(eg.pg/µL)}×洗脱体积(eg.µL) / DNA加入量理论值(eg.pg)×100%。

6）阴性质控NCS的Ct值应大于标曲最低浓度Ct的均值。

7）无模板对照NTC的检测结果应为Undetermined或Ct值≥35。

8）待测样本的Ct-IC值应该与NTC的Ct-IC值一致或±1，如果待测样本的Ct-IC值与NTC的Ct-IC值相比明显增大，则表明样本可能存在明显抑制。如果同时测试加标样本，则优先考虑样本加标回收率结果，IC结果作为参考。

 

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毕赤酵母宿主细胞DNA残留检测试剂盒 毕赤酵母残留DNA定量分析试剂

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毕赤酵母表达系统说明书

发表于由

毕赤酵母表达系统说明书

You can put the power of P. pastoris into your laboratory with a complete Pichia Expression Kit or with individual Pichia expression vectors. Three Pichia Expression Kits are available, each of which includes vectors, P. pastoris strains, reagents for transformation, sequencing primers, media, and a comprehensive manual （Table 3）. In addition, the pPICZ, pGAPZ, and pPIC6 vectors are available separay （see insert for ordering information）. Choose the kit or vector that best meets your research needs and take advantage of the proven strength of P. pastoris.

Table 3—Pichia expression kit components.

EasySelect™ Pichia

Expression Kit

Multi-Copy Pichia

Expression Kit

Original Pichia

Expression Kit

Vectors

pPICZ A, B, C 

（20 µg each）

pPICZα A, B, C 

（20 µg each）

pPIC9K （20 µg）

pPIC3.5K （20 µg）

pAO815 （20 µg）

pPIC9 （10 µg） 

pPIC3.5 （10 µg）

pHIL-D2 （10 µg）

pHIL-S1 （10 µg）

Strains

X-33 （Mut+

, His+

）

GS115 （Mut+

）

KM71 （MutS

）

GS115/pPICZ/lacZ 

（control）

GS115 （Mut+

）

KM71 （MutS

）

GS115/β-gal （control）

GS115/albumin （control）

GS115 （Mut+

）

KM71 （MutS

）

GS115/β-gal （control）

GS115/albumin （control）

Transformation 

reagents

Pichia EasyComp™ Kit

（120 transformations）

Spheroplast Module

（50 transformations）

Spheroplast Module

（50 transformations）

Sequencing

primers

5´ AOX1

3´ AOX1

α-factor

5´ AOX1

3´ AOX1

α-factor

5´ AOX1

3´ AOX1

α-factor

Media and 

supplements

YP base medium 

 （2 pouches）*

YP base agar 

 （2 pouches）*

Yeast Nitrogen Base 

 （1 pouch）†

 Zeocin™ （250 mg）

YP base medium 

 （2 pouches）*

YP base agar

 （2 pouches）*

Yeast Nitrogen Base 

 （1 pouch）†

YP base medium 

 （2 pouches）*

YP base agar

 （2 pouches）*

Yeast Nitrogen Base

 （1 pouch）†