1包被缓冲液，

（1）碳酸盐缓冲液（PH9.6 +0.2  0.05M） 《激素酶免疫测定技术》石老师编著

　          Na₂CO₃1.59g

　　　　　　NaHCO₃　       2.93g

加蒸馏水至1000ml。

（2）tris缓冲液（0.05mol/L）50ml 0.1mol/L

（Tris）溶液与x ml 0.1mol/L 盐酸混匀后，加水稀释至100ml        《酶免疫测定技术》杨立国等编著

某一特定pH值的0.05mol/L Tris缓冲液的配制：将50ml 0.1mol/L Tris碱溶液与上表所示相应体积（单位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水将体积调至100ml

3）0.02mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）

磷酸二氢钾        0.2g

磷酸氢二钠        2.90g

氯化钠            8g

加去离子水定容到1000ml。

2洗涤缓冲液（pH7.4   0.15mol/L）   《激素酶免疫测定技术》石老师编著

0.05%Tween-20       0.5ml

加在PBS缓冲液1000ml中。

PBS缓冲液：

　　　　　　KH₂PO₄ 　　         0.2g

　　　　　　Na₂HPO₄·12H₂O　　  2.9g

　　　　　　NaCl　 　            8.0g

　　　　　　KCl　　             0.2g

　　　　加蒸馏水至1000ml。

3测定缓冲液（Ph7.0  含0.87﹪NaCl 和0.1﹪BSA的0.1M磷酸缓冲液）用于标准孕酮，孕酮酶标物及奶样的稀释。   《激素酶免疫测定技术》石老师编著

        Na₂HPO₄·12H₂O    21.85g

         NaH₂PO₄·2H₂O      6.08g

         NaCl               8.70g

BSA               1.00g

溶于1000mL蒸馏水中

4封闭缓冲液

牛血清白蛋白（BSA）   2%    2g

　　　　　　（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100 ml。

0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）+2.0%BSA

2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸盐缓冲液溶解定量至100ml

5底物缓冲液（pH5.4）磷酸盐-柠檬酸缓冲液

     0.2M  Na₂HPO₄（无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L） 取25.7ml

　　 0.1M  柠檬酸（无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L）   取24.3ml

　加蒸馏水至100ml。

或

柠檬酸（C6H8O7·H₂O）    0.47g

Na₂HPO₄·12H₂O               2.00g

6（1） TMB（四甲基联苯胺）显色液（蓝色）

A液（3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，TMB）:称取TMB20mg溶于10ml无水乙醇中，*溶解后，加双蒸水至100ml。

B液（0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸氢二钠缓冲液，pH5.0-5.4）:称取Na₂HPO₄·12H₂O14.34g，柠檬酸1.87g溶于180ml双蒸水，加0.75%过氧化氢尿素1.28ml，定容至200ml，调pH至5.0-5.4。

将A液和B液按1：l混合后即成TMB-过氧化氢尿素应用液

或

TMB（2mg/ml水）          0.05ml

　　　　    底物缓冲液      　　　   0.95ml

　　　　    30%  H₂O₂　　 　       0.001ml

            总体积1ml。

（2）OPD（邻苯二胺）显色液（黄棕色）（现配避光）

  OPD（干粉）             0.004g

  底物缓冲液                10ml

  30%  H₂O₂                    0.015ml

 总体积10ml。

（3）TMBS底物液（用于显色）  《激素酶免疫测定技术》石老师编著

10mg四甲基联苯胺硫酸盐（TMBS）的二甲基亚砜溶液，用底物缓冲液配成0.2mg/ml的TMBS底物液。用前加H2O2溶液30﹪左右。

7  终止液  2mol/LH2SO4   用于终止反应

　在178.3ml水中，逐滴加入浓硫酸（18M，约98%）21.7ml，边加边摇。（浓H2SO4：蒸馏水=1:9）

来自加拿大麦克马斯特大学等处的研究人员发表文章，发现一种药物：硫利达嗪（Thioridazine）能成功消灭人体癌症干细胞，从而避免了传统癌症治疗方法引起的毒副作用。这一重要的成果公布在5月24日的Cell杂志上。

领导这一研究的是加拿大麦克马斯特大学干细胞与癌症研究院科学主任Mick Bhatia教授，他表示，“这项研究发现不同寻常之处在于，这种已有药物实际杀死癌症干细胞的方式——将这些癌症干细胞变成正常非癌变细胞”。Bhatia教授一直致力于癌症干细胞的研究，他曾*次论证了人类正常干细胞和癌症干细胞的区别。

15年以来，科学家们都认为干细胞是许多癌症的源头。1997年加拿大的科学家*次在某种白血病中识别出了癌症干细胞，自此癌症干细胞便陆续在血癌，乳腺癌，脑癌，肺癌，胃肠道癌症，前列腺癌以及卵巢癌中被发现。

与正常干细胞不同，癌症干细胞不会分化成稳定的，非分裂细胞类型，之前Bhatia教授曾利用一种筛选平台，按照其表达的基因和起反应的药物来定义这两者之间的差别，从而能够开发能更好地对付癌细胞而不损害健康细胞的疗法和药物。

而这项研究中，Bhatia教授和他的同事通过药物研发模型，筛选了上百种化合物，从中鉴别出来将近20种潜在的癌症干细胞特异性药物，其中一种可能zui有潜力的药物就是这种称为硫利达嗪的化合物。

硫利达嗪（Thioridazine）实际上是一种治疗精神疾病的药物，可以通过靶向大脑中的多巴胺受体，来治疗精神躯体障碍所致焦虑和紧张状态。这种药物其实并不能杀死癌症干细胞，但是却能促进癌症干细胞分化，从而消耗干细胞的自我更新能力。

研 究人员发现，硫利达嗪能由此消灭白血病干细胞，并且不会影响正常血液干细胞，将白血病患者体内的癌症干细胞蛋白与正常血细胞中的蛋白进行比较，能帮助解释 这种特异性。血癌细胞与正常血液干细胞不同，前者表面能表达一种多巴胺受体，而多巴胺受体也能在某些乳腺癌细胞中表达。

“这进行了一些解释”，Bhatia教授说，而且这也说明多巴胺受体也许能作为一种罕见肿瘤驱动细胞的生物标记物。

利用这些发现，Bhatia教授研究组目前正计划进行硫利达嗪这种FDA批准药物的临床实验，结合标准的成人急性髓细胞白血病抗癌药物，以及这种药物进行治疗。

“我们很高兴看到能将这种药物引入临床”，Bhatia教授说，“我们也希望这一平台能成为其它癌症干细胞药物筛选的流水线。”

蛋白激酶将磷酸基团从ATP 转移到蛋白多肽底物上的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基，直接影响目标的活性和功能。放射性研究表明，真核细胞中大约30%的蛋白经过磷酸化修饰。这一关键的 翻译后修饰调控了广泛的细胞活性，包括细胞周期、分化、代谢和神经元通讯。此外，异常的磷酸化事件与许多疾病状态相关。在评估磷酸化时，选择的方法可能会 有所不同，这取决于多个因素，包括提出的具体问题以及特殊仪器或试剂的可用性。如何检测蛋白磷酸化，本文简要介绍了几种常用方法，并提出了每种方法的优点 和缺点。

激酶活性分析

蛋白激酶通常是多个信号转导网络的常见组分，它们影响了众多负责生物反应的下游效应物， 因此，评估某个特定激酶的活性可能为平行通路提供宝贵信息。生物学样品中的激酶活性通常是在体外测定的，在ATP的存在下将免疫沉淀的激酶与外源底物共同 孵育。之后通过一些报告系统来评估特定激酶对底物的磷酸化，包括显色、放射性或荧光检测。此外，R&D Systems还提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能够定量任何可产生ADP的激酶的活性。尽管我们能够获得有关特定激酶行为的信息，但评估细胞提取物中的酶活性仅仅揭开了信号通路的冰山一角。我 们对蛋白如何被修饰还知之甚少，且体外活性分析也不能说明内源磷酸酶活性的潜在作用。磷酸化蛋白的直接检测可能为细胞如何应对外界刺激提供更详细的分析， 因为磷酸化肽段的鉴定为蛋白的表达和功能状态提供信息。

磷酸化特异抗体的开发

直接测定蛋白磷酸化的一种经典方法是将整个细胞与放射性标记的32P-磷酸盐共同孵育， 获得细胞提取物，通过SDS-PAGE分离，并曝光在胶片上。这种繁琐的方法需要多次几小时的孵育，且使用放射性同位素。其他传统方法包括2D凝胶电泳， 这种技术假定磷酸化会改变蛋白的迁移率和等电点。

鉴于这些方法很费力，磷酸化依赖抗体的开发受到研究人员的极大欢迎。1981年，*个 有记录的磷酸化抗体在兔子中产生，使用的是钥孔虫戚血蓝蛋白（KLH）的苯甲酰磷酸结合物。这一抗体广泛地识别了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，利用合成 的磷酸化肽段来免疫兔子，开发出多个磷酸化状态特异抗体，这些磷酸化肽段代表了目标蛋白磷酸化位点周围的氨基酸序列。之后将免疫血清上样到肽段亲和柱中， 产生高度特异的免疫试剂。磷酸化特异抗体的出现为传统方法的改进以及新的免疫分析技术的开发打开了大门。在任何技术中使用磷酸化特异抗体的忠告是，成功的 检测依赖于抗体与目的磷酸化蛋白的特异性和亲和力。

Western Blot

Western blot是评估蛋白磷酸化状态的zui常用方法，大部分细胞生物学实验室都拥有开展这些实验的设备。利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上（通常 是PVDF或尼龙膜），之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。典型的Western blot实验步骤避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理要求。许多磷酸化特异抗体十分灵敏，可轻松检测常规样品（如10-30 µg细胞提取物）中的磷酸化蛋白。由于测得的磷酸化蛋白水平可能随处理或凝胶上样误差而变化，研究人员常常利用一个抗体来检测同源蛋白的总水平（而不考虑 磷酸化状态），以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。化学发光和显色法都很常用，而分子量marker常用来提供蛋白分子量的信息。

酶联免疫吸附分析（ELISA）

ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。ELISA的定量能力优于 Western blot，且在调节激酶活性和功能的研究中表现出巨大的作用。这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。随后让目的蛋白结 合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品（如细胞裂解液）中的一个组分。加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。这些分析通 常设计为显色或荧光检测。产生的信号强度与zui初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优 点。首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。第三，ELISA的灵敏度更高允许 使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。zui后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。ELISA通常带来了激酶活性的间接测定。不过，另一类ELISA技术使用固定化的捕获抗体、底物和磷酸化底物的检测方法，带 来激酶活性的更直接测定。

基于细胞的ELISA

尽管体外生物化学激酶分析（如典型的三明治ELISA）常用于假说检验和药物筛选，但它 们无法复制细胞内的环境。分析完整细胞内的蛋白磷酸化也许能更准确地代表特定信号通路网络的状态。一些免疫分析zui近被开发出来，能够在完整细胞的背景下测 定蛋白磷酸化。细胞在同一个孔中被刺激、固定和阻断。使用磷酸化特异抗体，利用荧光或显色检测系统来评估磷酸化状态。此外，在微孔板的同一个孔中同时检测 磷酸化蛋白和总蛋白。因此，来自目的蛋白的信号可通过第二种蛋白来标准化，校正各孔之间的差异，实现磷酸化蛋白水平的准确评估，并比较多个样品，与传统免 疫印迹中使用磷酸化特异和总蛋白抗体相似。这些分析绕过了制备细胞裂解液的需要，因此更适合高通量分析。

细胞内流式细胞术和ICC/IHC

传统的细胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组织化学（ICC/IHC）是检测磷酸化事 件的有力工具。流式细胞仪利用激光来激发用于抗体检测的荧光染料。在评估同一个细胞中的多个蛋白时，必须精心选择滤光片组合和荧光染料，其光谱不能重叠。 流式细胞术很有优势，因其实现了快速、定量的单细胞分析。通过细胞表面标志的分型可检测异质群体中特定细胞类型的蛋白，而无需在物理上分离细胞。通过这种 方法可分析稀有的细胞群体，而不用担心细胞损失或细胞分选过程中可能发生的蛋白表达变化。

ICC通常指的是利用显微镜对培养细胞中的蛋白进行检测，而IHC指的是对完整组织切片 中的蛋白进行检测。与流式细胞术相似，这些技术实现了细胞或组织内多个蛋白的评估，只是要足够重视，避免荧光光谱或颜色的重叠。荧光和显色检测技术都经常 使用。与监控磷酸化的其他形式不同，ICC通常是确定细胞内定位的方法。流式细胞术和ICC/IHC都需要高亲和力、高特异性的抗体、阻断步骤、对照 和抗体滴定，以避免因非特异性结合而带来的不明确结果。

通过流式细胞术和ICC来检测磷酸化蛋白要求蛋白是稳定的，且抗体能够接近。细胞通常经 过刺激，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交联磷酸化蛋白，使其稳定，便于分析。固定后的细胞必须经过透化处理，让磷酸化特异抗体可进入细胞。对于不同的亚细胞 定位，通常使用不同的透化技术。温和的去垢剂可实现细胞质蛋白的检测，而抗体要想接近核蛋白，可能需要使用酒精。酒精透化也可增强磷酸化特异抗体的磷酸化 蛋白检测，因酒精具有变性的特点。

质谱

复杂的生物样品（如细胞裂解液）中蛋白质磷酸化的全面评估（磷酸化蛋白质组学）对于了解 基于磷酸化的信号网络很重要。复杂的蛋白混合物中大规模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鉴定，以及磷酸化残基的测序。质谱（MS）技术是完 成这些任务的有用工具。尽管质谱在鉴定单个蛋白上具有出色的灵敏度和分辨率，但对于磷酸化蛋白的分析，还有一些固有的困难。首先，磷酸化肽段的信号通常较 弱，因为它们带负电荷，而电喷雾质谱在正电模式下作用，因此电离效果不好。其次，在大量非磷酸化蛋白的高背景之下，很难观察到低丰度目的蛋白的信号。为了 克服这些缺点，人们已经开发出一些富集策略，包括固定化金属亲和层析（IMAC）、磷酸化特异抗体富集、化学修饰法（如磷酸化丝氨酸和苏氨酸的β-消去反 应），以及用生物素化的基团取代磷酸基团。

多个分析物图谱分析

质谱技术如碰撞诱导解离（CID）和电子转移解离（ETD），提供了肽段序列和翻译后修 饰（磷酸化）的全面平行分析。这些技术相当费力，而当特定通路作为主要研究目标时，可能不需要全面的磷酸化分析策略。这导致一些同时测定多个分析物的蛋白 磷酸化的新方法被开发出来。总的来说，这些方法涉及到磷酸化特异抗体的使用，包括基于微孔板、磁珠和膜，基于磁珠和基于膜的检测形式。这些分析zui明显的好 处在于通量能力被大大提高，避免了运行多个Western blot或传统的ELISA分析的需要。这些技术也能够提供更多的数据，而所需的样品量极少。相应地，蛋白图谱分析通常被认为灵敏度不及传统的对应技术， 因潜在的抗体交叉反应性。

磷酸化蛋白多重分析

新的基于微孔板的Proteome Profiler 96 Phospho Antibody Arrays

特点：

• 高达16个分析物/孔

• 3小时的快速分析时间

• 低的样品量要求

• 化学发光和近红外检测

• 易于高通量

结论

评估蛋白磷酸化往往是细胞生物学家保留曲目中*的一部分，可了解引起细胞活性的细 胞内因子。考虑到激酶扮演的重要角色，研究人员必须要有的工具，才能测定蛋白磷酸化和/或激酶活性。每种技术在不同的背景下发挥优势，因此必须精心挑 选实验设计的方法。这篇综述简要介绍了一些评估蛋白磷酸化的zui常用方法。由于需求在不断增长，方法也在不断改善，让研究人员能够更深入地了解这些复 杂而重要的过程，zui终控制细胞功能。

如何测量小鼠组织中的胶原蛋白？

介绍
胶原蛋白是脊椎动物体内丰富的蛋白质。胶原蛋白的准确分析对于胶原蛋白发挥重要作用的疾病研究以及纯化胶原蛋白在生物医学、化妆品或营养品行业的应用都很重要。
虽然胶原蛋白是人体的主要成分，但它是一种难以纯化和定量的分子。这部分是由于胶原蛋白分子通过不同类型的
交联，使胶原蛋白分子不溶，难以提取。
商用胶原蛋白分析的数量和类型有限。基于用天狼星红沉淀胶原蛋白分子，存在一些可溶性胶原蛋白的检测方法。然而，这种方法似乎不太适用于组织中胶原蛋白的分析。*泛使用的胶原蛋白分析是基于胶原蛋白水解为游离氨基酸，然后用HPLC或比色法测量胶原蛋白特异性羟脯安酸。然而，这些分析方法费时费力，需要特殊设备。为了克服这些缺点，我们最近开发了QuickZyme总胶原蛋白测定法，该法基于酸水解和比色检测的相同成熟原理，但速度更快，无需特殊设备。
在本应用说明中，我们比较了不同的测定方法，以测定各种小鼠组织中胶原蛋白的能力。我们使用QuickZyme总胶原蛋白测定法（酸水解，羟脯安酸比色检测）、HPLC“金标准”法（酸水解，羟脯安酸HPLC检测）和QuickZyme可溶性胶原蛋白测定法（酸/胃蛋白mei提取，天狼星红结合，比色检测）。

方法
处死健康小鼠（C57Bl6，8-10周龄），分离以下组织：肺、肝、肾、脾、心和真皮。此外，我们还以牛肌腱为样本。将组织/器官分为三部分，其中一部分用于湿重测定、干重测定（在冷冻干燥组织后）、在6 M HCl中的酸水解（10 mg湿组织/100µl 6M HCl，最小体积为200µl）以及通过HPLC或使用比色QuickZyme总胶原蛋白测定法定量羟脯安酸。另一部分直接用于湿重测定，然后使用QuickZyme总胶原蛋白测定法进行酸水解和羟脯安酸定量。第三部分用于湿重测定，用0.5 M醋酸/胃蛋白每过夜培养提取胶原蛋白，然后离心，并使用天狼星红可溶性胶原蛋白测定法进行定量。各种化验的化验原理见图1。

图1：。可溶性胶原蛋白测定法（左）、HPLC法总胶原蛋白测定法（中）和比色法总胶原蛋白测定法（右）的测定原理

后果
-通过酸水解，然后通过HPLC或QuickZyme比色法对胶原蛋白进行定量，两者之间的相关性非常好，并产生类似的值

图1：HPLC和羟脯安酸比色分析的比较。数值表示µg胶原蛋白/mg湿组织

水解可以用湿组织进行，也可以用干组织进行，结果相似。

图2：湿组织和干组织中羟脯安酸分析的比较。数值表示µg胶原蛋白/mg组织

-用基于天狼星红的可溶性胶原蛋白分析法分析各种组织中的可溶性胶原蛋白，得出了不同的结果，其值远低于总胶原蛋白的值，许多组织甚至接近检测极限。与QuickZyme总胶原蛋白测定法相比，可溶性胶原蛋白分析法测得的总胶原蛋白水平要低得多，例如肺2.5%，肾10%，脾8%，真皮9%，肌腱3%。低值可能是由于从大多数组织中提取的成熟胶原蛋白不足。
-用不同方法测量的各种组织中的胶原蛋白含量如表1所示。很明显，每个器官的胶原蛋白水平各不相同，肌腱的胶原蛋白含量最高，其次是皮肤、肺、脾、肾、心脏和肝脏。

表1 通过酸水解，然后通过HPLC或QuickZyme比色分析，分析各种组织中胶原蛋白的近似量（每毫克湿重组织中含有µg胶原蛋白）。

-组织在6 M HCl（最小体积HCl 200µl）中以100 mg/ml（湿重，湿重/干重比见表3）水解，水解产物用4M HCl稀释，如表2所示，35µl稀释水解产物用于总胶原蛋白分析（根据分析手册中的方案）。如表2所示，使用QuickZyme总胶原蛋白分析的最佳稀释因子因组织而异。确定该稀释系数时，应确保不存在基质效应（如果样品稀释不足，则会发生），且该值符合标准线的范围。

-各种组织的湿重与干重之比介于5.0（肺）和3.5（肌腱和皮肤）之间。湿组织或干组织中的胶原蛋白分析得出了类似的结果（数据未显示）。
-在肝组织水解物中，由于稀释程度较低的样品中出现基质效应，稀释因子为5-10。这导致OD值较低（接近或低于标准线中的低浓度）。因此，对于这种类型的组织，我们开发了一种改良的胶原蛋白分析方法，在该方法中未观察到基质效应，因此不需要稀释水解物（见第7页的说明，QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析）。

 结论
•每个组织的胶原蛋白含量不同：肌腱>皮肤>肺>肾>脾>心脏>肝脏
•基于天狼星红的胶原蛋白分析不太适合组织中的胶原蛋白分析，可能是因为从组织中提取的胶原蛋白有限
•定量组织中胶原蛋白的最佳方法是充分水解组织，然后通过HPLC或比色法分析羟脯氨酸
•QuickZyme总胶原蛋白分析非常适合组织中的胶原蛋白分析，结果与HPLC相似，但快速、简单，不需要特殊设备。
•对于胶原蛋白含量低、基质效应大的组织样品，我们开发了QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析。

QuickZyme Biosciences已开发了一系列用于分析任何物种胶原蛋白的分析方法，每种方法都有不同的应用领域
QuickZyme Biosciences提供胶原蛋白分析：
•QuickZyme可溶性胶原蛋白分析
•QuickZyme总胶原蛋白测定
•QuickZyme羟脯安酸测定
•QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析
•QuickZyme敏感组织羟脯安酸测定

QuickZyme可溶性胶原蛋白测定
该分析可识别可溶性或（酸/胃蛋白每）可溶性胶原蛋白。该分析为比色法，采用96孔板格式，基于胶原与天狼星红（一种含磺酸基的阴离子染料）的沉淀。这种染料可以结合碱性氨基酸残基的侧链。染料在高pH下从沉淀的络合物中释放，然后进行比色检测。该分析经过优化，以使其他蛋白质（如白蛋白）不会干扰。明胶（未折叠的胶原蛋白）不被该分析所识别。
应用：该方法用于测定细胞培养条件培养基中的可溶性胶原蛋白和细胞提取物中的可溶性胶原蛋白（酸或酸/胃蛋白每）。由于组织中成熟胶原蛋白的提取效率非常低，因此该方法不太适合测量组织提取物中的胶原蛋白。
QuickZyme总胶原蛋白测定
该分析可识别所有类型的胶原，无论其形式如何（成熟、未成熟、前胶原、降解胶原、交联胶原、各种来源的胶原）。
该分析为比色法，采用96孔板格式，并基于羟脯安酸的定量，羟脯氨酸是一种仅存在于胶原蛋白中的氨基酸。含胶原蛋白样品经酸水解后，羟脯安酸从胶原蛋白中释放出来。水解在950C下进行，产品可直接用于羟脯安酸分析，无需洗涤或干燥步骤。该分析基于已建立的氯胺T/DMBA方法。
用途：该方法用于测定总胶原蛋白。这包括所有胶原类型和形式，例如：前胶原、未折叠胶原、成熟胶原以及样品中所有胶原类型的胶原降解产物。由于第一步是样品的*水解，提取胶原蛋白的困难不起作用。该分析适用于各种类型的样品，包括组织。

QuickZyme敏感组织胶原测定
用羟脯安酸比色法测定组织样本中的胶原蛋白时，一个常见的并发症是出现所谓的基质效应，这是由样本中未识别的成分引起的。矩阵效应可能导致错误的高值或低值。可以通过稀释样品来防止基质效应。然而，这种稀释会导致样品的有效灵敏度较低，这对于小型
胶原蛋白含量低的样品。
与其他基于羟脯氨酸的分析相比，QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析没有基质效应，也不需要稀释水解物，从而能够在低胶原蛋白浓度的小样本中进行测量。该方法简单，不需要酸水解后的干燥步骤，通常需要特殊设备。
应用：该方法用于测量组织样本中的胶原蛋白，尤其是低胶原蛋白含量的组织，如肝脏。
QuickZyme羟脯安酸测定
该测定方法与总胶原蛋白测定方法相似，不同之处在于没有胶原蛋白水解的方案和材料，也没有胶原蛋白标准，但提供了羟脯安酸标准。
应用：该分析与总胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己的水解方法或收集水解样品进行分析的客户。
QuickZyme敏感组织羟脯安酸测定
该测定方法与敏感组织胶原蛋白测定方法相似，不同之处在于没有胶原蛋白水解的方案和材料，也没有胶原蛋白标准，但提供了羟脯安酸标准。
应用：该分析与敏感组织胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己水解方法或收集水解样品进行分析的客户。

如何选择您的胶原蛋白检测试剂盒？

胶原蛋白是脊椎动物体内丰富的蛋白质，约占全身蛋白质的30%。它们在组织结构中起着重要作用，并具有许多其他功能，如细胞生长、分化、组织修复和许多病理条件。
胶原蛋白是一个细胞外基质蛋白家族；在脊椎动物中，至少鉴定出27种胶原类型，具有42条不同的多肽链。I型、II型、III型、V型、XI型、XXIV型、XXVII型胶原是形成原纤维的胶原，含有三重螺旋结构，能够捆绑成原纤维。
胶原的特点是存在稳定胶原三螺旋所需的羟脯氨酸残基。
一些胶原的组织分布有限，例如II、IX和XI型胶原几乎只存在于软骨中，IV型胶原的存在仅限于基底膜。I型、II型和III型胶原是组织中含量丰富的胶原。
虽然人体中存在超过3公斤的胶原蛋白，但胶原蛋白是一种难以纯化和分析的分子。这部分是由于胶原蛋白分子通过不同类型的交联形成了广泛的网络，这使得胶原蛋白分子不可溶且难以提取。

目前，对于胶原蛋白的分析，存在各种类型的分析方法：
-ELISA检测胶原特异性前体结构域
-ELISA检测特定类型的胶原蛋白
-利用特异性胶原抗体进行蛋白质印迹
-组织切片天狼星红染色
-基于天狼星红的可溶性胶原蛋白分析
-样品水解后羟脯氨酸残留的测定（通过比色试剂盒或HPLC）。
QuickZyme Biosciences开发了一套分析胶原蛋白的方法，无论是从任何物种和任何组织中可溶的还是不溶的。
QuickZyme Biosciences提供胶原蛋白分析
•QuickZyme可溶性胶原蛋白分析
•QuickZyme总胶原蛋白测定
•QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析
•QuickZyme羟脯氨酸测定
•QuickZyme敏感组织羟脯氨酸测定

QuickZyme可溶性胶原蛋白测定
该分析可识别可溶性或（酸/胃蛋白酶）溶解的纤维状胶原蛋白。
该分析为比色法，采用96孔板格式，基于胶原与天狼星红（一种含磺酸基的阴离子染料）的沉淀。染料在高pH下从沉淀的络合物中释放，然后进行比色检测。对测定进行了优化，使其他蛋白质（如白蛋白）不会干扰。明胶（变性胶原蛋白）不被该分析所识别。该试验需要可溶性或可溶性的原纤维胶原。
应用：该方法用于测定细胞培养基中的可溶性胶原蛋白和细胞提取物中的可溶性胶原蛋白（酸或酸/胃蛋白酶）。化验不是胶原蛋白分析：哪种化验可以用于什么应用？
建议用于组织，因为大多数组织胶原蛋白是交联的和不溶的。

QuickZyme总胶原蛋白测定
该分析可识别所有类型的胶原蛋白（成熟、未成熟、前胶原、降解胶原蛋白、交联胶原蛋白、各种来源和种类的胶原蛋白）。
该分析为比色法，采用96孔板格式，并基于羟脯氨酸的定量，羟脯氨酸是氨基酸脯氨酸的一种改良版本，几乎只存在于胶原蛋白中。含胶原蛋白样品经酸水解后，羟脯氨酸从胶原蛋白中释放出来。水解在95℃下进行，水解产物可直接用于羟脯氨酸分析，无需洗涤或干燥步骤。
应用：该方法用于总胶原蛋白的定量。这包括所有前胶原、未折叠胶原、成熟胶原以及样本中所有胶原类型的胶原降解产物和明胶。由于第一步是样品的*水解，提取胶原蛋白的困难不起作用。该分析适用于所有类型
样本，包括任何物种的组织。由于组织样品中的未知物质，该分析受到基质效应的影响。在许多样品中，可以通过稀释水解物来防止这种影响。如果由于胶原蛋白浓度较低（例如在肝组织中），因此不需要充分稀释水解物，我们建议使用敏感组织
胶原蛋白测定QuickZyme羟脯氨酸测定
该测定与总胶原蛋白测定相似，不同之处在于不包括胶原蛋白水解的方案和试管。
应用：该分析与总胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己的水解方法或收集待分析水解样品的客户。
QuickZyme敏感组织胶原测定
该测定法与QuickZyme总胶原蛋白测定法非常相似，但不受基质效应的影响，因此是低胶原蛋白浓度和大量基质效应的肝组织等组织的测定法。
应用：该测定法用于测定（组织）样品中的总胶原蛋白，该样品具有低浓度的胶原蛋白和基质效应，需要在QuickZyme总胶原蛋白测定中稀释

QuickZyme敏感组织羟脯氨酸测定
该试验与QuickZyme敏感组织胶原蛋白试验相似，不同之处在于不包括胶原蛋白水解的方案和管道。
应用：该分析与QuickZyme敏感组织胶原蛋白分析具有相同的应用领域，但适用于有自己的酸水解方法或收集待分析水解样品的客户。