Eukaryotes mRNA forms a special structure at the 5'end after transcription, which is the cap structure. The cap structure plays an important role in the stability, transportation and translation of mRNA. Vaccinia virus capping enzyme is an effective enzyme that can catalyze the formation of the cap structure. It’s composed of two subunits D1 and D12. It also has RNA triphosphatase activity, guanylate acyltransferase activity and guanine methyltransferase activity, could connect the 7-methylguanine cap structure (m7Gppp) to the 5'end of the RNA (m7Gppp5'N). Vaccinia virus capping enzyme can cap the RNA at correct direction within one hour when present at suitable concentration of capping buffer, guanosine triphosphate (GTP), S-adenosylmethionine (SAM), etc..

This product is produced in accordance with GMP process requirements and provided in a liquid form, used for in vivo/in vitro pre-translation mRNA capping reaction or mRNA 5'end labeling reaction.

Product Properties

Contents

Shipping and Storage

mRNA Vaccinia Capping Enzyme GMP-grade products are shipped with dry ice and can be stored at -15℃ ~ -25℃ for one year.

Experimental methods

Cap1 capping reaction (20 μL reaction system)

This step is suitable for capping reaction of 10 μg RNA (≥ 100 nt), and can be amplified according to experimental needs.

1. Take 10 μg RNA to a 1.5 mL centrifuge tube and dilute to 12.9 μL with nuclease-free water;

2. Heat at 65°C for 5 min;

3. Take out the centrifuge tube and place it on ice for 5 min;

4. Add the following components in sequence:

【Note】10×Capping Buffer(Cat# 10666)：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT pH 8.0 @ 25°C.

5. Incubate at 37°C for 2 h;

6. RNA capping is completed, next experiments can be performed.

Notes

1. For your safety and health, please wear personal protective equipment (PPE), such as laboratory coats and disposable gloves, when operating with this product.

2. The extracted RNA needs to be purified and resuspended in nuclease-free water;

3. The RNA solution needs to be heated before adding the enzyme to remove the secondary structure at the 5'end;

4. For RNA with a known 5'end structure, the reaction time can be extended to 4 h to improve the capping efficiency;

5. In the 5'end labeling reaction system, the GTP stock solution should be diluted to 1-3 times of the mRNA molar concentration in the reaction system.

HB230818

产品描述

真核生物中mRNA经转录后修饰在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性，可将7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp）连接到RNA的5'末端（m7Gppp5'N）。牛痘病毒加帽酶，在合适浓度的加帽缓冲液（Capping buffer），鸟苷三磷酸（GTP），S-腺苷甲硫氨酸（SAM）等存在条件下，能够在一个小时之内对RNA进行加帽，并且保证正确的方向。

本品以无菌液体形式提供，可应用于体内/体外翻译前mRNA的加帽反应或mRNA的5'末端标记反应。

产品性质

产品组分

运输和保存方法

干冰运输。 -15℃ ~ -25℃保存，有效期一年。推荐分装保存，避免反复冻融。

使用方法

加帽反应（反应体系20 μL）

本步骤适用于10μg RNA（≥ 100 nt）的加帽反应，且可根据实验需要放大。

1. 取10μg RNA至1.5 mL离心管，使用无核酸酶的水稀释至9.5 μL；

2. 65℃加热5 min；

3. 取出离心管置于冰上5 min；

4. 依次加入以下组分：

【注】：10×Capping Buffer(Cat# 10666)：0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT pH 8.0 @ 25°C。

5. 37°C孵育2 h；

6. RNA加帽完成，可进行后续实验。

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；

2. 所提取的RNA需经过纯化并使用无核酸酶的水重悬；

3. 在加入酶之前需要对RNA溶液进行加热以去除5'末端的二级结构；

4. 对于已知5'末端结构的RNA，可以延长反应时间至4 h，提高加帽效率；

5. 5'末端标记反应体系中，GTP储液应稀释为反应体系中mRNA摩尔浓度的1-3倍。

HB220701

Q: 酶法加帽中先升温再降温的目的是什么？在放大生产时好像很难做到先升温再降温。

A: 先升温是为了把RNA二级结构打开，让RNA处于单链状态。如果不进行这步操作的话，会影响加帽的效率。这部分目前的确是工艺生产上的难点。现在有的公司直接在模板序列确定时会对RNA的二级结构作预测，加帽酶只识别mRNA前几个核苷酸，如果确定这部分结构不会产生RNA的二级结构的话，可以不进行加热。

Q: 帽类似物加帽和酶法加帽如何选择？

A: 工业上酶法加帽最常使用的是牛痘病毒加帽酶处理IVT产物可以将其修饰成Cap 0 mRNA，Cap 0结构可以在二氧甲基转移酶（2'O-methyltransferase）的作用下进一步修饰成Cap 1（m7GpppmN）。利用酶法加帽，加帽效率可以达到95%以上。共转录加帽法操作简便，但由于GTP会竞争帽状二聚体，因此该方法加帽率低一些；两种方式各有优缺点。

Q: 加帽优化的方式有哪些？

A: 通过增加VCE的量例如100ul体系加入10ul即100U的酶活，主要是增强VCE的甲基转移酶活性，也可以通过增加SAM（0.5mmol）增强鸟苷转移活性，增加加帽率。例如我们的新款单链加帽酶，它的加帽率显著提升，就是鸟苷转移活性比传统的更好，对于传统VCE，小亚基D12容易沉淀形成聚合物，纯化时容易损失，所以成本更贵，批次不能控制。

Q: 对于一些没有加上帽子的mRNA，会对后续实验比如说做生物制剂等有什么影响？

A: 目前行业对这一块的没有做针对性的去除，行业里面主要是看加帽效率的多少，目前做的比较好的加帽率在80%以上，当然肯定是越高越好了。这个还没有一个绝对的标准。

对于合成之后的mRNA，可以用纯化的方式处理，比如康*的一步膜包，极大的减少了纯化工艺，传统用Oligo d（T）的柱子做纯化，效果好可以回收率70-80%；效果差40-50%，也可以多加一步疏水柱在oligo dT后。

Q: 共转录加帽和两步法加帽对于模板的起始位点的要求？

A: 共转录要求对于模板的起始位点要求必须是 AGG* 开头

两步法对于位点无要求，但我司目前产品对于AGGG起始位点的产量最高，主要是T7酶的偏好性导致。