产品描述

鲎试剂为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的冷冻干燥品，鲎试剂中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。

动态浊度法内毒素检测鲎试剂（Kinetic Turbidimetric LAL Assays）是通过检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度来检测内毒素的方法。在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活C因子，引起一系列酶促反应，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。随着凝胶的形成，反应液的吸光度(OD值，浊度)增加，OD值增加的速度与内毒素浓度成正相关。换言之，OD值上升某一预设限值(启动OD)所需要的时间(定义为启动时间)与内毒素浓度成负相关，启动时间的对数与内毒素浓度的对数成线性关系，据此，可以定量供试品的内毒素浓度。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。4℃避光保存，有效期2年。

注意事项

1. 该试剂盒用于体外细菌内毒素的定量检测，严禁试剂以任何途径进入机体。

2. 接触试剂及供试品的所有器皿必须是除热原的。试验过程应防止微生物的污染。

3. 该说明书中的除热原指内毒素浓度小于 0.005 EU/mL。

4. 供试品的 pH 值应在 6.0-8.0 之间，若超出此范围，需用除热原的缓冲液、0.1 M 氢氧化钠或 0.1 M 盐酸调节。

5. 当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验，参见【供试品的干扰试验】。

6. 本产品仅作科研用途！

所需材料和设备

1. 试剂：内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查用水。

2. 器材：

除热原试管、除热原吸头、除热原加样槽、除热原96孔微板。

旋涡混合器、移液器、多道移液器、试管架。

带温育系统的动态光度测定仪器及配套软件，例如，微板鲎试仪ELx808及软件TALgent 或Gen5。

操作方法

1. 动态光度测定仪器的设定，以微板鲎试仪ELx808为例：

预热仪器，设置温育温度为37℃，设置模板及程序。设定读板波长为340 nm、630 nm，设定动力学参数：读板90-120分钟， 每读板间隔30-150 s。

2. 内毒素标准溶液配制

2.1 标准曲线所采用的内毒素浓度可以为2至10倍稀释的系列(如0.5，0.25，0.125，0.0625 EU/mL 或10，1，0.1，0.01 EU/mL))。

2.2 取内毒素工作标准品1支，用砂轮沿安瓿颈部划痕，开启，加入适量（建议在0.5 mL-1.2 mL之间）细菌内毒素检查用水，置旋涡混合器上剧烈振摇5分钟。

2.3 将上述内毒素溶液进一步用细菌内毒素检查用水稀释成所需浓度，每稀释一步均应在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟。稀释的内毒素溶液静置时间超过10分钟，用前在旋涡混合器上剧烈振摇1分钟，配置时间超过4小时的内毒素溶液应丢弃。(参见《内毒素工作标准品使用说明书》)。

3. 阴性对照为细菌内毒素检查用水。

4. 鲎试剂的溶解：按标示量加细菌内毒素检查用水于鲎试剂中，轻轻振摇使鲎试剂完全溶解。注意不要用旋涡混合器剧烈

振摇。溶解的鲎试剂应在10分钟内使用。若采用多道移液器，将溶解的鲎试剂转移到除热原加样槽，并轻轻摇匀。

5. 实验操作（微板鲎试仪ELx808）：

5.1 取除热原微板，在各孔中分别加入100 μL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。

5.2 将微板放置于鲎试仪中，37℃温育10分钟。

5.3 温育结束，用移液器或多道移液器加入100 μL 鲎试剂（避免产生气泡!)，中速振摇10 秒混匀，在340 nm波长处，每30秒（到60秒）读一次，读板120分钟。

数据处理

设定启动OD(可以设为0.02, 一般可以在0.02到0.04之间)，软件自动给出其启动时间(T)。

建立标准曲线：lgT = b lgC + a，其中T为启动时间，C为内毒素的浓度，b为直线斜率，a为Y轴截距。

当实验数据同时满足如下三个条件时实验才有效：

1. 标准曲线的浓度点≥ 3，标准曲线的相关系数r ≤ -0.980，

2. 标准曲线最低点的T值小于阴性对照的T值，

3. 供试品平行管的平均值在标准曲线的区间内。

【供试品的干扰试验】

1. 当对新药或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，必须进行干扰试验；

2. 当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变，或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，必须重新进

行干扰试验；

3. 当供试品中可能存在鲎试验的干扰物质时，须进行干扰试验。

4. 步骤如下：

4.1 选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度，如采用标准曲线为10，1，0.1，0.01 EU/mL 系列时, 可以用供试品配制0.1 EU/mL 内毒素浓度作为实验的供试品阳性对照。

4.2 用供试品溶液配制浓度为λm 的内毒素溶液（即含λm 内毒素的供试品阳性对照），测量出该溶液的内毒素浓度，称为Cs；

4.3 测量出未添加外源内毒素的供试品溶液内毒素浓度，称为Ct；

4.4 计算该试验条件下的回收率R＝（Cs–Ct）/λm × 100%

4.5 当R在50%～200%之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在明显干扰作用。

4.6 当R在50%～200%之外，需对供试品进行系列稀释或进行其它处理消除干扰, 每一稀释溶液都重复步骤2-4, 直到内毒素的回收率R在50%～200%之间。选择回收率R最接近100%的稀释倍数进行内毒素检测。

(参见《中华人民共和国药典》2020 版中《细菌内毒素检查法》)

HB220607

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产品简介

Endotoxin Removal Agarose Resin是一种用于去除生物源蛋白类产品(包括蛋白、多肽、抗体、多糖等)中内毒素的树脂。其原理是将修饰过的多粘菌素B连接至4%琼脂糖微球上，进行特异性去除内毒素，经纯化可将样品中内毒素降低至0.1 EU/mL，且样品回收率高。

产品信息

产品性质

储存条件

2~8℃保存，有效期2年。

需准备试剂

所用水和Buffer以及耗材均需无热原处理，防止在使用过程中引入内毒素。

平衡液：20 mM 磷酸盐，150 mM NaCl，pH7.4。

再生液：1% Triton X-114的平衡液

【注】平衡液和洗脱液可根据样品性质进行改变，建议pH7-8, NaCl约150 mM-500 mM。

使用说明

【注】a 样品在上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子；

   b 内毒素结合柱子的最佳pH为6-9，因此样品pH最好控制在7-8；

   c 样品最好控制在适当的离子强度，减少非特异吸附，NaCl约150 mM-500 mM。

样品纯化（以1 mL树脂为例）

1）装柱：充分混匀Endotoxin Removal Agarose Resin，用无热原枪头吸取适量浆液加入合适的层析柱中，注意避免产生气泡，打开下出口去掉保护液，用3 mL再生液进行清洗，控制流速在0.25 mL/min，或＜10滴/min，温度控制在2~8℃，重复至少2次，确保柱中无内毒素。

2）平衡：用3 mL的平衡液平衡柱管内壁及树脂，流干，流速约0.5 mL/min，温度控制在2~8℃，重复至少两次。

 3）过柱及检测：将样品加到平衡好的树脂中，调节流速在0.25 mL/min，或＜10滴/min，当流出液流出约1 mL 时，开始收集流出液，流干后加入1 mL平衡液继续收集。检测样品中内毒素含量及样品回收率。

【注】如果样品中内毒素含量仍高于目标值，继续重复1-3。

注意事项

1.本品可耐受试剂：20%DMSO,20%乙醇,20%甘油；1 M尿素,300 mM咪唑；0.05% Tween 20,10 mM DTT等。

2.本产品仅作科研用途。

3.为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

附表 问题及解决方案

Ver.CN20230719

Q：为什么内毒素去除效率低？

A：可能是样品pH 值不在内毒素结合范围内；建议用 0.1MNaOH 或 0.1M HCl 调节至 pH7-8。

Q：为什么样品被污染？

A：树脂纯化过其他样品；不用使用过的树脂去除不同样品内毒素。

Q：为什么样品回收率低？

A：可能是样品非特异性吸附在树脂上；建议增加样品和平衡液的NaCl 浓度。

Q：本品可耐受哪些试剂？

A：20%DMSO，20%乙醇，20%甘油；1M 尿素，300mM 咪唑；0.05% Tween 20， 10mM DTT 等。

Q：如何确定需要使用的填料体积？

A：可根据填料的内毒素载量，可检测自己样品中的内毒素含量确定；如果实在无条件检测自己样品中的内毒素的含量，初次实验可按照填料：样品体积比=1：1或1：2上样。

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