产品简介

MBPSep Dextrin Agarose Resin 是一种纯化带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签蛋白的亲和层析介质，MBP可促进连接蛋白的正确折叠，增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBPSep Dextrin Agarose Resin 6FF可以一步纯化MBP融合蛋白，结合的融合蛋白可以用10 mM麦芽糖进行温和洗脱，保护了目的蛋白的活性，MBP融合部分后续可用位点特异性蛋白酶切除。

此外，本品以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，具有更高的物理化学特性，可以耐受更高的压力，在相对较高的流速下，实现对目的蛋白的纯化，更适于工业大规模蛋白的纯化。

产品信息

产品性质

储存条件

2~8℃保存，有效期2年。

需准备试剂

所用水和Buffer在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。

平衡/洗杂缓冲液：20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH7.4

洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 10 mM 麦芽糖, pH7.4

【注】平衡/洗杂缓冲液或洗脱缓冲液中可加入1 mM DTT 或 10 mM β-巯基乙醇。

使用说明

【注】样品在上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤，减少杂质以防阻塞柱子。

1. MBPSep Dextrin Agarose Resin 6FF的装填（适用于各种中压色谱层析柱的填装）

1）用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2 cm的去离子水。

2）将树脂悬浮起来，小心的将浆液连续地倒入层析柱中。用玻璃棒沿着柱壁倒入浆液可减少气泡的产生。

3）如果使用储液器，应立即在层析柱和储液器中加满水，将进样分配器放置于浆液表面，连接至泵上，避免在分配器或进样管中产生气泡。

4）打开层析柱底部出口，开起泵，使其在设定的流速下进行。最初应让缓冲液缓慢流过层析柱，然后缓慢增加至最终流速， 这样可避免液压对所形成柱床的冲击，避免柱床形成的不均匀。如果达不到推荐的压力或流速，可以用所使用泵的最大流速，这样也可以得到一个很好的装填效果。

【注】：在随后的色谱程序中，不要超过最大装柱流速的75%，当柱床高度稳定后，在最后的装柱流速下至少再上3倍柱床体积的去离子水。标上柱床高度。

5）关闭泵，关闭层析柱出口。

6）如果使用储液器，去除储液器，将分配器至于层析柱中。

7）将分配器推向柱子至标记的柱床高度处。允许装柱液进入分配器，锁紧分配器接头。

8）将装填好的层析柱连接至泵或色谱系统中，开始平衡。如果需要可以重新调整分配器。

2. 样品纯化

1）平衡：用5倍柱体积的平衡Buffer平衡柱子，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。

2）上样：Resin平衡后，加入蛋白样品，使其与Resin充分接触，提高目的蛋白回收率，收集流出液。

3）洗杂：用10-15倍柱体积的洗杂缓冲液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4）洗脱：使用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液，收集洗脱液，即目的蛋白溶液。

5）清洗与保存：依次使用3倍柱体积的平衡Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，最后用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%乙醇中，置于2-8℃保存，防止填料被细菌污染。

3. SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

4.填料清洗

MBP标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生，但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集，会造成流速和结合载量性能下降，这时可按照下面方法对填料进行清洗。

1）3倍柱体积的去离子水；

2）3倍柱体积的0.1%SDS或0.1 M NaOH溶液；

3）3倍柱体积去离子水；

4）填料清洗后保存在等体积的20%乙醇中，置于2-8℃保存。

注意事项

1. 请勿冷冻保存本产品。
2. MBPSep Dextrin Agarose Resin 6FF使用前一定要充分颠倒若干次，使琼脂糖珠混合均匀。
3. 所有操作过程中，样本需要在4℃或冰上操作。
4. 本产品仅作科研用途。
5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
6.  

附表 问题及解决方案

Ver.CN20231117

Q：为什么柱子反压过高？

A：可能是填料被堵塞；裂解液中含有微小的固体颗粒，建议上样前最好用 0.22µm 或0.45µm 滤膜过滤，或离心去除。

Q：为什么洗脱组分中无目的蛋白？

A：先跑胶确定蛋白是未结合还是未洗脱，通过对比纯化样品、流穿液、洗脱液的目的蛋白条带确定。

如果是未结合：1、可能是样品或缓冲液中存在一些干扰因素如非离子去污剂；建议样品透析或用结合buffer 稀释。2、可能是标签聚集，可以加入1mM的DTT改善此情况。

Q：为什么洗脱样品较杂？

A：1、可以先尝试下在洗杂步骤提高盐浓度或者洗杂buffer中加入终浓度0.1%非离子型去污剂。

2、可能是目的蛋白降解；可以WB验证，建议加一些蛋白酶抑制剂，如 PMSF等。

Q：该产品使用之前能剧烈摇晃吗？

A：不能剧烈摇晃，会破坏高度交联的 6%琼脂糖微球；使用前可轻轻充分颠倒若干次， 使琼脂糖珠混合均匀。

Q：重复使用次数是多少？

A：具体使用次数与样品有关，可以耐受0.1 M氢氧化钠清洗5次后载量仍有80%以上。

Q：孵育法的操作步骤？

A：1）根据纯化的样品量，取适量填料加入离心管中，1000 rpm 离心 1 min，吸弃上清;

2)向离心管中加入5 倍介质体积的平衡液清洗介质，1000 rpm 离心1 min，吸弃上清，重复两次以上。

3)加入样品，封闭离心管，4℃振荡孵育 2-4 h 或者37度孵育30 min-2h。

4)孵育结束后，1000 rpm 离心1 min，吸弃上清，上清保留作为流穿，用于电泳鉴定。

5)用5倍介质体积的洗杂液清洗介质，1000 rpm 离心1 min ，去除上清（注意不要吸到介质），重复 3-5次，中间建议更换新离心管。

6)加入3-5 倍柱体积的洗脱液进行洗脱，温育 5 min，1000 rpm 离心1 min可重复 2-3次。

[1] Huang J, Wu X, Gao Z. The RING-type protein BOI negatively regulates the protein level of a CC-NBS-LRR in Arabidopsis. Biochem Biophys Res Commun. 2021;578:104-109. doi:10.1016/j.bbrc.2021.09.038(IF:3.575)