biosearchtech KASP 基因分型试验试剂盒
我们获得专有技术的基于PCR的KASP基因分型化学方法包括三个成分：样品DNA，KASP分析混合物和包含两个通用FRET卡盒的KASP Master混合物。
KASP试用套件包含
- 33个预稀释的DNA样品
- 2X KASP预混液
- 对照KASP测定混合物
从完成的KASP反应中读取荧光信号所需的全部是具有FRET功能的酶标仪或qPCR仪器。
KASP 基因分型试验试剂盒用户指南
本指南内容
1 简介
2 试剂盒内容物
3 进行 KASP 基因分型反应的实验程序
3.1 KASP 基因分型反应
3.2 试剂盒组装
3.3 KASP 基因分型混合物组装
3.4 实验程序
3.5 热循环条件
3.6 其他循环条件
4 订购信息
1. 简介
KASP™ 基因分型试验试剂盒作为使用 KASP 化学品的介绍提供。它使用户能够使用现有设备在自己的实验室中测试化学物质。
一般而言，任何能够在表 1 中波长处读取 FRET 的 qPCR 仪器或酶标仪均应与 KASP 兼容。
KASP 已在广泛的 qPCR 仪器上得到验证，包括：
• ABI 7500
• ABI 7300
• ABI 7900
• ABI ViiA7
• 罗氏 LC480
• Agilent Mx3000P/3005P
• illumina EcoRT
• BIO-RAD CFX
2. 试剂盒内容物
该试剂盒包含 KASP 基因分型检测试剂盒，包括检测混合物、主混合物和 DNA：
1. 1 x 96 孔微量滴定板，含 33 份 DNA 样品（和 3 份无模板对照），预稀释至适用于 KASP 基因分型反应的浓度范围。
2. 1 x 500µL 管的 2x 浓度的 KASP 主混合物（足以进行 100 次反应）
10µL）。
3. 1 x 管 KASP 测定混合物（72x 浓度）。
客户要求
1. 快速酶标仪（激发和发射详见表 1）
荧光团的值）
2. 一个预期用于客户基因分型过程类型的空 PCR 板
3. PCR 级水
4. 光学透明密封件。
|
荧光团 |
激发波长 (nm) |
发射 (nm) |
|
FAM |
485 |
520 |
|
六角 |
535 |
556 |
|
肾 |
575 |
610 |
表 1：KASP 化学中使用的荧光团及其各自的激发和发射波长。
3. 进行 KASP 基因分型反应的实验程序
3.1 KASP 基因分型反应
使用以下试剂制备 KASP 反应：
• 2x KASP 预混液
• 72x KASP 分析混合物
• DNA 样品（提供正确浓度的样品 DNA，用于 2x 稀释）
• 必要时加水定容至终反应体积。
3.2 试剂盒组装
384 孔板的总反应体积需要 5µL，96 孔板的总反应体积需要 10µL。
表 2 是如何为 384 和 96 孔板形式的 KASP 构建 60 个反应的示例。这将使您能够为 33 个样本和 3 个无模板对照 (NTC) 制备足够的基因分型混合物，并提供额外的备用体积。
3.3 KASP 基因分型混合物组装
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组分 |
60 次反应的湿 DNA 法 (µL) |
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|
板格式 |
384 孔板 |
96 孔板 |
|
2x KASP 预混液 |
150 |
300 |
|
分析混合液 |
4.2 |
8.4 |
|
水 |
N / A |
N / A |
|
总反应体积 |
5 |
10 |
|
总计 |
300 |
600 |
表 2：KASP 反应组件示例
3.4 实验程序
1. 解冻 KASP Master mix 和 KASP Assay mix 试管。涡旋每个试管，并在冰上储存。
2. 解冻 DNA 板。短暂涡旋并向下旋转微孔板。
3. 使用单通道或多通道移液器将 DNA 转移至空反应板（客户提供）。
– 对于 96 孔板：将提供的 5µL DNA 转移至各孔中。
– 对于 384 孔板：将提供的 2.5µL DNA 转移至各孔中。
4. 按照表 2 所述制备基因分型混合物 (2x KASP Master mix plus Assay mix)。向反应板中的每个 DNA 样品中加入所需量的基因分型混合物。该程序可使用单通道或多通道移液器。
– 对于 96 孔板：向各 DNA 样本中加入 5µL 制备的基因分型混合物。
– 对于 384 孔板：向各 DNA 样本中加入 2.5µL 制备的基因分型混合物。
5. 用光学透明密封件密封平板。
6. 将微孔板离心至少 550 次x g. 不要以比转子推荐的速度更快的速度旋转微孔板。
3.5 热循环条件
KASP 化学品可以与任何标准热循环仪一起使用。热循环条件详见表 3，请注意，使用了两步降落 PCR 方法，延伸和退火步骤合并为一个步骤。建议在分配 DNA 和基因分型混合物后尽快循环反应板。如果不可行，制备好的平板可在 4 ℃ 下储存长达 1 小时OC. 平板分装后应立即用光学透明密封件密封，以防止任何蒸发。
|
步骤 |
性状 |
温度 |
时间 |
每个步骤的循环次数 |
|
1 |
活化 |
94OC |
15 min |
1 |
|
2 |
变性 |
94OC |
20 s |
10 个周期 |
|
退火/伸长率 |
61-55OC |
60 s （下降 0.6OC/循环） |
||
|
3 |
变性 |
94OC |
20 s |
26 个周期 |
|
退火/伸长率 |
55OC |
60 s |
表 3：KASP 化学品的热循环条件
热循环后，读取微孔板。
请注意：所有平板的读数均应低于 40OC. 如果微孔板读数未低于 40OC，不可能分析基因分型数据。
3.6 其他循环条件
如果您尚未获得明确的基因分型簇，则应将平板热循环额外 3 个循环，并再次读取。回收条件请参见表 4。
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步骤 |
温度 |
时间 |
每个步骤的循环次数 |
|
变性 |
94OC |
20 s |
3 个周期 |
|
退火/伸长率 |
57OC |
60 s |
表 4：KASP 化学品进一步热循环的条件
在获得紧密的基因分型簇之前，可以进行进一步的循环和读取。
图 1 图 2
X 轴上报告的 FAM 等位基因
图 1：说明三个清晰簇的基因分型图示例。FAM 等位基因在 X 轴上报告（蓝色数据点），HEX 等位基因在 Y 轴上报告（红色数据点）。绿色数据
点代表杂合子样本，黑色数据点为无模板对照 (NTC)。
图 2：指示 KASP 基因分型试验试剂盒 DNA 样本预期基因分型结果的 96 孔板布局图。
注：本方案适用于所有三个试验套件部件编号。三种试剂盒之间的仅有差异是 KASP 主混合物中被动参比染料 ROX 的浓度，其根据使用的酶标仪类型而变化
4. 订购信息
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产品代码 |
性状 |
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KBS-1014-104 |
标准 Rox 试验套件 |
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KBS-1014-105 |
High Rox 试模套件 |
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KBS-1014-106 |
低 Rox 试验套件 |