celltechnology MITCAP说明书

MitoCasp

同时双参数测定：线粒体膜电位检测和半胱天冬酶（poly，3 / 7,8,9,1）活性。

产品代码：MITCAP

产品描述

主要优点

• 同时检测线粒体膜电位和半胱天冬酶活性。
• 读数 – 流式细胞仪，荧光板读数器，荧光显微镜。
• 可靠：产生定量和定性结果。给出了强烈的积极信号。
• 该试剂盒可与其他抗体或染色剂一起使用。
• 易于使用：无需制备细胞裂解液或进行蛋白质印迹。
• 细胞渗透性试剂。

背景

半胱氨酸蛋白酶检测

细胞凋亡是细胞自我杀的进化保守形式，其遵循专门的细胞过程。该过程的核心组成部分是一系列称为半胱天冬酶的蛋白水解酶。这些酶参与一系列反应，这些反应是响应促细胞凋亡信号而触发的，并导致蛋白质底物的裂解，导致细胞的解体（1）。

已经在从秀丽隐杆线虫到人类的生物体中鉴定了半胱天冬酶。哺乳动物半胱天冬酶在细胞凋亡和炎症中发挥不同的作用。在细胞凋亡中，半胱天冬酶负责导致细胞解体的蛋白水解切割（效应caspase），并参与上游调节事件（启动子半胱天冬酶）。活性半胱天冬酶由两个大的（~20kD）和两个小的（~10kD）亚单元组成，形成两个异二聚体，它们以四聚体（2-4）结合。与其他蛋白酶一样，半胱天冬酶被合成为经历蛋白水解成熟的前体，自催化或通过具有相似特异性的酶级联进行（5）。

线粒体膜电位检测

线粒体膜电位的丧失是细胞凋亡的标志。线粒体通透性转换是诱导细胞凋亡的重要步骤。在此过程中，线粒体膜上的电化学梯度崩溃。认为崩溃是通过二聚化的Bax或活化的Bid，Bak或Bad蛋白在线粒体中形成孔而发生的。这些促凋亡蛋白的活化伴随着细胞色素c释放到细胞质中（11-14）。

分析原则

Caspase（poly，3 / 7,8,9,1）和线粒体膜电位检测 – MitoCasp

半胱天冬酶特异性识别4个氨基酸序列（在其底物上），其必然包括天冬氨酸残基。该残基是裂解反应的目标，其发生在天冬氨酸残基的羰基末端（6）。可以通过免疫沉淀，使用半胱天冬酶特异性抗体的免疫印迹技术，或通过使用在半胱天冬酶切割后变为荧光的荧光底物来检测半胱天冬酶。MitoCasp使用一种新方法来检测活性caspase（7-9）。该方法基于羧基荧光素（FAM）标记的氟甲基酮（FMK） – 半胱天冬酶的肽抑制剂。这些抑制剂具有细胞渗透性和非细胞毒性。一旦进入细胞内，抑制剂就与活性半胱天冬酶（10）共价结合。

Cell Technology利用阳离子染料显示线粒体膜电位（15-17）。阳离子染料是可透过细胞的，并且在红色区域具有强荧光信号，并且表现出低的膜电位独立（非特异性）结合和毒性。在健康细胞中，阳离子染料由线粒体与DeltaPsi（膜电位）成比例地累积。在大多数细胞系中，阳离子染料在线粒体中的积累导致更高的荧光强度。在凋亡细胞中，线粒体膜电位受损，阳离子染料不会在线粒体中积累，并且这些细胞表现出较低的荧光信号。结合使用这两种试剂，可以同时分析Caspase活性和线粒体膜电位。

用Staurosporine刺激Jurkat细胞3小时（B）或DMSO（A）。然后根据方案用MitoCasp试剂盒染色细胞。然后将细胞洗涤两次并通过流式细胞术分析：Ex：488nm Em：FL1和FL2。

套件内容和长期存储