mdbioproducts常见实验室应用程序的故障排除

 

一般实验室技术

洗涤技巧：

多通道移液器或喷瓶  

确保移液器的每个尖头都正确分配或喷射瓶有足够的压力。清空孔中的内容物并用指示的洗涤缓冲液体积填充孔。倒出孔，倒置并在干净的纸巾上吸干。如插入所示重复此过程。最后一次倾析后，倒置去除任何剩余的洗涤缓冲液，并将其吸干在干净的纸巾上。不要让孔静置，按照插图中的指示进行下一步。注意：如果在倾析时条带变得松散，则在清洗和在干净的水槽中滗析之前对条带进行编号非常有用。

歧管分配器或自动清洗机

确保有适当的真空供应。检查所有插管或插脚是否正确分配和抽吸。通过抽吸或倾析清空孔。将每个孔填充到插入物中指示的适当体积。*吸出孔。去除缓冲液后，让抽吸装置留在孔中，不要过度抽吸孔。如插入物所示重复此过程，不要让孔在最后一次抽吸后保持干燥。

移液技术：

确保您使用的移液器已校准，并且移液器吸头正确且牢固地固定在移液器上。将移液器设置到所需的体积并用样品或试剂预冲洗。缓慢向上吸取试剂，使移液器缓慢返回向上位置。稍等片刻，让试剂在吸头中达到体积平衡。将试剂缓慢分配到第一次停止，然后轻轻分配到第二次停止。将移液器保持在此位置，直到将其从储液器或孔中取出，以避免将试剂吸回。当您取下移液器时，将吸头向上拉到容器或孔的一侧，以释放可能在吸头外侧的任何液体。

 

ELISA 故障排除

许多因素会影响 ELISA 的性能。

• 在开始之前仔细阅读说明。这将有助于避免不必要的错误。
• 使用良好的实验室规范和校准设备。
• 使用干净的容器和干净的实验室空间，并在每种试剂之间更换移液器吸头。
• 重复运行所有标准和样品，因为这将提高准确性。

精度差：

• 清洗不*：确保仪器工作正常，并且抽吸后孔看起来是干的。
• 试剂混合不均：确保试剂充分混合。
• 污染：确保使用干净的容器并在每种试剂之间更换移液器吸头。
• 移液错误：使用良好的实验室技术并确保正确校准移液器。

标准曲线：

• 标准品制备不当：确保正确配制标准品并遵守稀释说明。
• 清洗不*：确保仪器工作正常，并且抽吸后孔看起来是干的。
• 添加到孔中的体积不等：检查移液器是否已校准以及移液器吸头是否正确就位。
• 确保从净 OD 中减去空白和 NSB 值。

高背景：

• 确保正确洗涤板。回顾上面的洗涤技术。
• 遵守所有孵化时间和温度。高背景可能是由于孵育时间过长或在高于推荐温度的情况下孵育造成的。

 漂移

• 使用前将所有试剂置于室温。
• 在运行检测之前或按照试剂盒说明书中的指示准备试剂。
• 避免中断检测设置。

边缘效果

• 在环境条件下孵育板时，请注意温度变化或通风区域。将印版放在空调或暖气通风口下可能会导致颜色不均匀。

色彩发展

• 确保所有试剂以正确的体积和正确的时间添加到检测中。坚持正确的孵化时间。
• 除非试剂盒插页中另有说明，否则在加入终止溶液后立即读取板。
• 底物是否正确准备和添加

IHC 故障排除

 无染色

问题		可能的解决方案）
一抗和二抗可能不匹配。		建议二抗针对产生一抗的物种（例如，如果一抗是在小鼠中产生的，则使用抗小鼠二抗）。
该抗体可能不适用于以天然（非变性）形式显示蛋白质的 IHC 程序。		在非变性和变性蛋白质印迹上测试抗体，以确保抗体识别非变性抗原。
二抗未避光保存。		建议避免将二抗暴露在光线下。
没有足够的一抗与目标蛋白质结合。		减少抗体稀释。 在 4°C 下孵育更长时间。
感兴趣的蛋白质并不大量存在于组织中。		运行阳性对照。 利用放大步骤可以帮助放大信号。  使用较低稀释度的一抗。
目标蛋白是核蛋白，抗体不能穿透细胞核。		为了促进细胞核的渗透，在封闭缓冲液和抗体稀释缓冲液中加入透化剂。
脱蜡可能不够		将切片脱蜡时间更长。 使用新鲜制备的二甲苯。
福尔马林和多聚甲醛等固定剂可能会改变抗体识别的表位。		使用抗原修复方法揭露表位。 修复时间更短。
PBS 缓冲液可能被细菌污染，这些细菌已经破坏了目标蛋白质。		在 PBS 抗体储存缓冲液中使用防腐剂，如 0.01% 叠氮化物。 使用新鲜的无菌 PBS。

 高背景

问题		可能的解决方案）
非特异性结合的阻断可能是不够的。		将切片的封闭潜伏期延长至 30 分钟，将细胞培养延长至 1 小时。使用封闭剂，例如 10% 正常血清用于切片，1-5% BSA 用于细胞培养。
一抗浓度可能太高。		将抗体滴定至更佳浓度，使用更多稀释液孵育更长时间。这将提供更慢但更具体的绑定。
二抗可能非特异性结合。		在没有一抗的情况下运行二级对照。
孵化温度可能太高。		在 4°C 下孵育组织切片或细胞。
组织未充分洗涤。		在所有步骤之间用 PBS *清洗
内源性过氧化物酶是有活性的。		使用酶抑制剂，如碱性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
福尔马林和多聚甲醛等固定剂太强，可能已经改变了抗体识别的表位。		改变抗原修复方法。 减少抗原暴露溶液的孵育时间。
应用了过多的基材。		减少底物孵育时间。
色原与细胞中存在的 PBS 发生反应。		在与底物一起孵育之前，使用 Tris 缓冲液清洗切片。
透化已经损坏了膜并去除了膜蛋白。		从缓冲液中去除通透剂。

 

非特异性染色

问题		可能的解决方案）
一抗或二抗的浓度可能太高。尝试降低抗体浓度和/或潜伏期。		将信号强度与不表达目标的细胞进行比较。
一抗是针对与染色组织相同的物种产生的（例如在大鼠组织上测试的大鼠一抗）。		当应用二抗时，它会与所有组织结合，因为它也是针对该物种产生的。使用针对与您的组织不同的物种产生的一抗/二抗。
内源性过氧化物酶是有活性的。		使用酶抑制剂，如碱性磷酸酶的左旋咪唑 (2 mM) 或过氧化物酶的 H2O2 (0.3% v/v)。
切片/细胞已变干。		将组织切片和细胞保持在高湿度下，不要让它们变干。