proaxsis ProteaseTag主动弹性蛋白酶免疫操作指南

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proaxsis  ProteaseTag ® 主动弹性蛋白酶免疫操作指南

ProteaseTag® Active Neutrophil Elastase Immunoassay

 

免疫测定分为两个部分：
1）一个较大的盒子[58 cm x 38 cm x 35 cm; 体重±10公斤（体重主要是由于凝胶袋）]，其包含需要保持在4℃冷却并且必须投入在接收到冰箱的液体瓶，
和
2）一个小的内“冷冻箱” [39厘米× 27厘米x 28厘米; 重量±7公斤（重量主要归因于干冰）]，我们在干冰上单独发送。

因此，每个套件将[快递]分2个单独的包裹寄送，总重为±17公斤。

试剂盒内容物

 

冷冻箱组件

 

NE标记

1小瓶含4µl（浓度10 mM）捕获探针

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)

人中性粒细胞弹性蛋白酶标准品

2瓶含6µl天然NE（浓度100µg/ml）的酸性缓冲液

NE结合物

1瓶含25µl

稳定性溶液中与辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体

 

主要试剂盒组分

 

免疫分析板

96孔链霉亲和素包被微量滴定板（预封闭）

NE清洗缓冲液A浓缩液

24 mL 25倍浓度的缓冲表面活性剂（含防腐剂）

NE洗涤缓冲液B浓缩液

8 mL含防腐剂的25倍浓度缓冲液

NE标准品稀释剂

15 mL含防腐剂的缓冲液（即用型）

NE试剂稀释剂

2 x 13 mL含防腐剂的缓冲表面活性剂（即用型）

TMB底物

12 mL四甲基联苯胺（即用型）

终止液

6 mL 2N硫酸（即用型）

封板机

4个粘合条

 

需要但未提供的材料

  • 去离子水或蒸馏水
  • 经校准的移液器和相应的移液器吸头
  • 试管和试管架
  • 清洁稀释清洗缓冲液的容器
  • 涡旋
  • 培养箱(37 ℃)
  • 能够在450 nm处读数的经校准的微量滴定板读数器

 

试剂制备

除标准品和样品外，所有试剂均应在使用前恢复至室温。使用前，标准品和样品必须始终置于冰上。

提供了足够的试剂，可获得两条标准曲线。

_清洗缓冲液A-用576 mL去离子水稀释24 mL浓缩液，制成600 mL清洗缓冲液A

_清洗缓冲液B–量取8 mL浓缩液，加入192 mL去离子水中，制成200 mL清洗缓冲液B

_NE结合物–用11980µl NE试剂稀释剂稀释20µl NE结合物，制备12 mL结合物溶液（600倍稀释）

_NE-Tag–用11997.6µl NE试剂稀释剂稀释2.4µl NE-Tag，制备12 mL NE-Tag溶液（5000倍稀释）

_标准品-

  • 移取495µl NE标准品稀释液至一个微量管中
  • 移取250µl NE标准品稀释液至6个后续微量管中
  • 向试管中加入5µl NE标准品。从一个试管移取250µl至下一个试管，进行连续稀释。转移至下一试管前，充分混匀各试管。这将创建具有以下NE浓度的校准曲线：1000、500、250、125、62.5、31.25和15.625 ng/mL
  • 使用NE标准品稀释剂作为零（空白）标准品

_样品-使用NE标准品稀释剂适当稀释。

 

试验程序

所有样品和标准品均应重复测定两次。

  1. 按照上文所述制备所有试剂、标准品和样品。建议在加至微孔板之前立即制备标准品和样品
  2. 从铝箔袋中取出平板
  3. 使用300µl/孔清洗缓冲液A抽吸并清洗每个孔。重复该程序两次，共

3次清洗

  1. 向各孔中加入100µl稀释的NE-Tag。用封板覆膜覆盖，并在37 ℃下孵育30 min
  2. 使用300µl/孔清洗缓冲液B抽吸并清洗每个孔。重复该步骤两次，总计

3次清洗

  1. 向各孔中加入100µl稀释标准品、样品和空白。用封板覆膜覆盖，并在37 ℃下孵育30 min
  2. 使用300µl/孔清洗缓冲液A抽吸并清洗每个孔。重复该程序两次，共

3次清洗

  1. 向每个孔中加入100µl稀释的结合物。用封板覆膜覆盖，并在37 ℃下孵育60 min
  2. 使用300µl/孔清洗缓冲液A抽吸并清洗每个孔。重复该程序两次，共

3次清洗

  1. 每孔加入100µl TMB底物溶液。用封板覆膜覆盖，并在37 ℃下孵育10 min。避光保存
  2. 向各孔中加入50µl终止液。孔内颜色应从蓝色变为黄色
  3. 在15 min内使用设置为450 nm的酶标仪测定每个孔的光密度。

 

结果计算

计算各标准品、对照品和样品重复两次读数的平均值，并从终结果中减去零空白。通过生成log x-轴绘制标准曲线，并将曲线拟合为样条曲线或4参数逻辑拟合。如果样品已被稀释，则应根据稀释因子校正报告的浓度。

 

检测试剂盒的局限性

正确存储所有组件(_s)

_使用所有未开封的试剂在其有效期内

_请勿与其他批次或来源的试剂混合或替代

_所有程序均应按照方案进行

_如果样品产生的结果高于高标准品，则应使用NE标准品稀释剂进一步稀释样品并重复。

 

技术提示

_本试剂盒仅供有资质的人员使用

_按照国家和当地法规以安全方式处置容器和未使用的内容物

_为避免交叉污染，在添加各标准品、样品和试剂之间更换移液器吸头。此外，每种试剂使用单独的储液器

_为确保结果准确，在孵育步骤期间必须适当粘附封板覆膜

_囊性纤维化患者痰液或支气管肺泡灌洗液(BALf)用NE标准稀释液稀释至少100倍。COPD样本的建议起始稀释度为10倍