encapsula包含DOTAP的阳离子脂质体列表
（Genesome®）（普通和荧光）
| 尺寸 | 货号 | 脂质组成 | 价格 | 数量 | 小计 |
|---|---|---|---|---|---|
| 2毫升 | GEN-7000 | DOTAP（100％） | $ 750.00 |
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| 2毫升 | GEN-7001 | DOTAP：胆固醇（1：1） | $ 750.00 |
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| 2毫升 | GEN-7002 | DOTAP：DOPE（1：1） | $ 750.00 |
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| 2毫升 | GEN-7036 | DOTAP：Chol：DOPE（1：0.75：0.5） | $ 750.00 |
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| 2毫升 | GEN-7008 | 含有0.5％DiI（荧光）的DOTAP（100％） | $ 850.00 |
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| 2毫升 | GEN-7007 | 含0.5％DiO（荧光）的DOTAP（100％） | $ 850.00 |
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| 2毫升 | GEN-7003 | DOTAP：胆固醇（1：1）含有0.5％NBD-DOPE（荧光） | $ 850.00 |
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| 2毫升 | GEN-7004 | DOTAP：含有0.5％Rhod-PE（荧光）的胆固醇（1：1） | $ 850.00 |
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| 2毫升 | GEN-7005 | 含有0.5％NBD-DOPE（荧光）的DOTAP：DOPE（1：1） | $ 850.00 |
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| 2毫升 | GEN-7006 | 含有0.5％Rhod-PE（荧光）的DOTAP：DOPE（1：1） | $ 850.00 |
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| 2毫升 | GEN-7037 | 含有0.5％NBD-DOPE（荧光）的DOTAP：Chol：DOPE（1：0.75：0.5） | $ 850.00 |
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| 2毫升 | GEN-7038 | 含有0.5％Rhod-PE（荧光）的DOTAP：Chol：DOPE（1：0.75：0.5） | $ 850.00 |
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描述
阳离子脂质体传统上用于传递遗传物质，例如各种类型的DNA（pDNA，cDNA，CpG DNA，寡核苷酸，反义寡核苷酸等），各种类型的RNA（例如siRNA，mRNA等）和核酸酸模拟物（NAM）。 将DNA封装到常规的中性带电荷的基于PC的脂质体中可能是一个技术问题，主要是由于质粒的大小。由于这个问题在80年代后期，已经开发了由阳离子脂质和PE组成的脂质体。这个想法是用阳离子脂质的正电荷中和pDNA的负电荷，以便主要由于静电相互作用有效地捕获更多质粒并将其传递到细胞中。通常，该程序仅基于将阳离子脂质体与DNA或RNA混合并将其添加到细胞中即可。这导致骨料的配方。
为了设计合适的阳离子脂质用于基因传递，已将两种方法用于阳离子脂质合成：1）基于胆固醇的设计，例如DC-胆固醇和GL-67脂质，以及2）非基于胆固醇的设计，例如作为DOTAB，DDAB和DOTMA。 为了使用脂质体在体外成功转移基因，应考虑一些因素： i）结合和包装脂质体中DNA / RNA的能力； ii）包装的DNA / RNA与细胞表面的相互作用； iii）DNA / RNA内在化的效率； iv）万一发生内吞作用，从内体释放细胞内DNA； v）细胞核中的转基因表达水平。 已根据其在酸性条件下释放其含量的趋势设计了对pH敏感的脂质体。主要概念基于病毒，该病毒通过pH 5-6的蛋白质与内体膜融合，并在到达溶酶体之前将其遗传物质传递到细胞质中。 通常，pH敏感脂质体由二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）组成。由于磷脂酰乙醇胺（PE）在酸性条件下会发生变化，因此据信它可以充当膜融合促进剂。 脂质体与细胞之间相互作用的有效性高度依赖于脂质体组合物。脂质体通过各种内吞过程捕获，效率取决于细胞类型和脂质体大小。各种大小和电荷的脂质体可通过吞噬作用附着于巨噬细胞和嗜中性粒细胞。脂质体附着到细胞表面后，由于早期内体的酸性更高（6.50），内化进入内体。通过成熟或囊泡融合将脂质体转移到酸性更高的pH（5.5-6.0）的后一个内体，这需要10-15分钟。摄取后二十分钟（或更长时间），内含物被递送至pH 5.0或更低的溶酶体。溶酶体是内吞途径中主要的降解和后的内吞区段，pH不敏感的脂质体在其中积累和降解。但是，在pH敏感脂质体渗透到细胞中后，不会发生积累和降解。
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配方信息
包含DOTAP的阳离子脂质体（Genesome®）（普通和荧光）
有关上述脂质体脂质组成的更多信息，请单击此处。
| 缓冲液和脂质体大小 | 规格 |
|---|---|
| 缓冲 | 去离子无核糖核酸水 |
| pH值 | 7 |
| 脂质体大小 | 100纳米 |
荧光阳离子脂质体的荧光染料
| 荧光染料 | 激发/发射（nm） | 分子结构 |
|---|---|---|
| 1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI） | 549/565 | |
| 3,3'-二亚油基氧杂碳菁高氯酸盐（DiO） | 484/501 | |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（7-硝基-2-1,3-苯并恶二唑-4-基）（铵盐） | 460/535 | |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（lissamine罗丹明B磺酰基）（铵盐） | 560/583 |
氮/磷（N / P）比
基于阳离子胺氮（在阳离子脂质中）和DNA磷酸基团浓度计算正负电荷之比。 DNA和RNA是核苷酸的聚合物。它们通过磷酸二酯键（一种特定类型的共价键）结合在一起，该磷酸二酯键可以长到数百万个核苷酸。由于存在构成每个核苷酸的磷酸根基团（戊糖+含氮碱基+磷酸根），DNA和RNA带负电。当形成磷酸二酯键的一部分时，它们保留2个负电荷中的1个。失去另一个负电荷以形成与新戊糖的另一个酯键。这就是将该键称为“磷酸二酯”的原因。例如，阳离子脂质DOTAP具有以下结构。
DOTAP具有一个氮，因此每个分子带一个正电荷。1纳摩尔的DOTAP可贡献1纳摩尔的正电荷。一些阳离子脂质含有一个以上的氮，但并非所有的氮原子都带有正电荷。对于其他脂质，请查看它们的分子结构以找到分子中氮原子的数量。
siRNA脂质体
RNA与DNA不同，是单链分子。但是，siRNA是双链的。例如，在一个长21 bp的siRNA分子中，由于碱基对中有2个核苷酸，并且每个核苷酸带有一个负电荷，因此存在42个负电荷。
DNA电荷计算
1 µg DNA可产生3.1 nmol带负电的磷酸盐。
阳离子脂质-鱼精蛋白-DNA（LPD）复合物
鱼精蛋白是一种高度带正电荷的聚阳离子肽，分子量为5.1 kDa，可作为DNA缩合试剂。已知鱼精蛋白是精子核中用于浓缩DNA的主要成分。所有鱼精蛋白都含有精氨酸，并且是强碱性的（等电点= 11-12）。
由脂质鱼精蛋白-DNA（LPD）组成的脂质多聚体是通过鱼精蛋白预压缩的DNA与阳离子脂质体的结合而产生的。这与通过阳离子脂质和DNA之间直接静电相互作用形成的阳离子脂质体-DNA脂质复合物相反。脂质鱼精蛋白-DNA具有净正表面电荷，据信对于其与阴离子细胞表面蛋白聚糖的结合是*的。细胞表面的这种静电相互作用触发脂质-DNA复合物的内吞作用进入细胞。
向DNA和阳离子脂质体中添加鱼精蛋白的顺序非常重要。一种方案涉及将质粒DNA与硫酸鱼精蛋白预复合，然后添加阳离子脂质体。该协议有两个缺点。其中之一是需要大量过量的阳离子脂质才能实现大水平的基因表达。通常，阳离子脂质/ DNA摩尔比必须大于35，才能有效体内转染。另一个问题是难以制备浓缩样品。这是由于鱼精蛋白硫酸盐与质粒DNA的强烈相互作用，这使得高浓度鱼精蛋白/ DNA复合物的制备变得困难，尤其是在需要高鱼精蛋白/ DNA比（w / w）的情况下。为了解决这些问题，已经开发了第二种方案，其中将硫酸鱼精蛋白与阳离子脂质体混合，然后添加质粒DNA。由于阳离子脂质体和鱼精蛋白之间竞争与质粒DNA的相互作用，大大降低了鱼精蛋白和DNA之间的强相互作用。在一定条件下，这将导致形成平均直径小于150 nm的LPD。
为了计算正负比率，您需要考虑：
- 1 mol的鱼精蛋白硫酸盐贡献21 mol的正电荷（硫酸鱼精蛋白的MW约为5.1 kDa）。
- 1 nmol的单阳离子脂质可贡献1 nmol的正电荷。
- 1 µg DNA可产生3.1 nmol带负电的磷酸盐。
Lipoplex的插入后PEG化
聚乙二醇化已在脂质体学领域广泛使用了数十年。聚乙二醇化的好处是*的，包括改善脂质复合体的系统循环。然而，脂质复合体的PEG化的缺点也已经被很好地证明。这包括防止脂质复合物与靶细胞缔合以及抑制DNA从内体区室释放，这导致非常低的转染效率。
随着掺入阳离子脂质体中的PEG化脂质的分子量增加，阳离子脂质体的细胞毒性增加。例如，含有PEG5000的脂复合物比含有PEG2000的脂复合物更具细胞毒性。阳离子脂质体的转染活性随PEG-DSPE脂质百分比的增加而降低。先前的研究表明，添加0.5％PEG-PE会使肺中的原始荧光素酶活性降低至原荧光素酶活性的60％，1％降低至40％，2％降低至10％。还据报道，将PEG-PE（1％的阳离子脂质）添加到新形成的质粒-脂质体复合物中可以防止复合物在储存期间聚集。但是，将含有PEG-PE的复合物在4°C下储存会缓慢恢复其原始活性。一般来说，对于转染实验，不使用聚乙二醇化。但是，在某些实验中，尤其是在体内实验中，使用了聚乙二醇化的脂质复合物。
如果您需要进行涉及阳离子脂质体聚乙二醇化的实验，那么强烈建议首先通过将适量的遗传物质添加到脂质体中，然后在外部添加聚乙二醇化脂质（插入后）并孵育脂质体来形成脂质复合物。然后将PEG脂质在高于阳离子脂质的液相到凝胶相转变温度的温度下放置1小时（如果是不饱和阳离子脂质，例如DOTAP，则可以在室温下孵育）。
在许多实验中，不是使用传统的PEG2000-DSPE，而是将C8-PEG2000-神经酰胺用于脂质体的PEG化，因为PEG-神经酰胺是“脱落的PEG”，在与生物膜接触时会从脂质体中扩散出来。
细胞活力测定
由于脂质体制剂中使用的阳离子脂质具有细胞毒性，因此强烈建议进行细胞生存力分析。可以通过改良的Alamar蓝分析法评估细胞活力。阿拉玛蓝含有氧化还原指示剂，该指示剂在细胞代谢的氧化还原范围内均显示荧光变化。简而言之，将10μL的10％（v / v）Alamar蓝色染料添加到100μL样品中。在37ºC下孵育2小时后，在荧光分光光度计上在570 nm和600 nm上读取所得的荧光。使用以下公式计算细胞活力（对照细胞的百分比）：
技术说明
- Genesome®产品是使用无去离子RNAse的水配制的。
- N / P比是指氮磷比。N代表氮，而不是负，并且氮带正电。P代表磷酸盐，不是正值。磷酸盐带有负电荷。因此，N / P比也代表正负比。一些阳离子脂质含有一个以上的氮，但并非所有的氮原子都带有正电荷。例如，DC-胆固醇具有两个氮原子，并且其中只有一个带正电。羧基旁边的氮不是带正电荷的，因此不应该包括在N / P计算中。
- 细胞毒性也可以按照制造商的说明使用CytoTox96®非放射性细胞毒性测定法（Promega，麦迪逊，威斯康星州）进行评估。
- 脂质体应保持在4°C且切勿冷冻。
外貌
PlainGenesome®是由纳米级单层脂质体制成的白色半透明液体。FluorescentGenesome®制剂带有颜色，其颜色取决于所用荧光染料的类型（有关外观，请参见SDS）。通常由于脂质体小，在小瓶底部不会发生沉淀。将脂质体包装在琥珀色的小瓶中。