biochain Z5030012说明书

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Malachite Green Phosphate Assay Kit

 

 

孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒

总览

 

BioChain的孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒基于对孔雀石绿，钼酸盐和游离正磷酸盐之间形成的绿色络合物的定量分析。通过分光光度计（600 – 660 nm）或酶标仪可以方便地测量反应迅速形成的颜色。非放射性比色测定试剂盒已经过优化，可提供出色的灵敏度和更长的保存期限。该测定方法简单，快速，只需一个添加步骤即可测定磷酸盐。可以在试管，比色皿或多孔板中进行测定。可以在96和384孔板中方便地进行测定，以高通量筛选酶抑制剂。

描述

BioChain的基于细胞的测定试剂盒可满足制药和生物技术客户不断增长的需求，这些需求源于从基因组学和蛋白质组学衍生出来的大量药物靶标。我们的客户正在寻求在基于细胞的系统中进行大规模筛选，因为准确而完整的细胞数据很有希望并可以代表生物的生理状况。该试剂盒配有用于该测定的所有试剂的完整系统和易于遵循的方案

 

 

孔雀绿磷酸盐检测试剂盒 (Z5030012)

 

孔雀绿磷酸盐检测试剂盒是基于对孔雀绿、钼酸盐和游离正磷酸盐之间形成的绿色复合物进行定量。可在分光光度计 (600-660 nm) 或酶标仪上方便地测定反应快速显色。对非放射性比色测定试剂盒进行了优化，以提供优越的灵敏度和延长的有效期。该测定法简单、快速，涉及磷酸盐测定的单个加入步骤。可在试管、比色皿或多孔板中执行测定。该试验可方便地在 96 孔和 384 孔板中进行，用于高通量筛选酶抑制剂。

 

关键特征

试剂非常稳定。由于我们的创新配方，不会发生试剂沉淀。因此，测定前无需过滤试剂，这是其他市售试剂盒的常见要求。

高灵敏度和宽检测范围：检测低至 1.6 pmole 的磷酸盐，有效范围为 0.02 M 至 40 M 磷酸盐。

快速方便：均匀的“混合和测量”测定法可在 20 min 内定量测定游离磷酸盐。

与常规实验室和 HTS 格式兼容：可在试管、比色皿或微孔板、分光光度计和酶标仪上进行测定。

在 96 孔和 384 孔板中观察到稳健且适用于 HTS：Z' 因子为 0.7-0.9。可在 HTS 液体处理系统上轻松实现自动化。

应用

磷酸酶测定：从肽、蛋白质或小分子底物中释放磷酸盐。

脂肪酶测定：从磷脂中释放磷酸盐

核苷三磷酸酶测定：从核苷三磷酸盐（ATP、GTP、TTP、CTP 等）中释放磷酸盐。

磷脂、蛋白质和 DNA 等中磷酸盐的定量

药物发现：高通量筛选磷酸酶抑制剂。

试剂盒内容物：在 96 孔板中进行 2,500 次测定

试剂 A：50 mL 试剂 B：1 mL 标准品：1 mL 1 mM 磷酸盐

储存条件。试剂和标准品在 4 ℃ 下可稳定储存 1 年。

注意事项：试剂仅供研究使用。使用试剂时，应采取实验室试剂的常规预防措施。详细信息请参见材料安全数据表。

使用 96 孔板的程序

试剂制备。每次测定需要 20 L 工作试剂。通过混合 100 vol 试剂 A 和 1 vol 试剂 B（例如 5 mL 试剂 A 和 50 μL 试剂 B）制备足量的工作试剂。工作试剂在室温下可稳定储存至少 1 天。

重要提示：使用前必须将试剂恢复至室温。每次测定前，重要的是检查所有酶制剂和测定缓冲液中均不含游离磷酸盐。向 80µL 样品溶液中加入 20µL 工作试剂可方便地完成该操作。在 620 nm 处的空白 OD 值应低于 0.2，如果 OD 读数高于 0.2，检查磷酸水水平。双蒸水的 OD 读数通常低于 0.1。实验室清洁剂可能含有高水平的磷酸盐。*清洗后，确保实验室器具不污染磷酸盐。

  • 磷酸盐标准品的制备。通过移取 40 L 1 mM 磷酸盐标准品，置于 960 L 蒸馏水或酶反应缓冲液中，制备含 40 M 磷酸盐的预混溶液。试管编号。

按下表所示稀释标准品。移取 80 L 标准品，一式两份，置于透明底 96 孔板的孔中。加入仅含水或反应缓冲液的空白对照。

 

No

预混剂 + H2O

终体积

(mL)

磷酸盐

浓度 (M)

pmoles 磷酸盐

in 50 mL

1

200mL + 0mL

200

40

2,000

2

160mL + 40mL

200

32

1,600

3

120mL + 80mL

200

24

1,200

4

80mL + 120mL

200

16

800

5

60mL + 140mL

200

12

600

6

40mL + 160mL

200

8

400

7

20mL + 180mL

200

4

200

8

0mL + 200mL

200

0

0

2. 将 80µL 供试品转移至平板的不同孔中。

注：在酶反应的情况下，可通过加入特定抑制剂终止反应，或通过加入工作试剂直接终止反应。试验前可能需要稀释反应混合物（见一般注意事项）。对于 ATP 酶或 GTP 酶测定，ATP 或 GTP 浓度应低于 0.25 mM，如果反应混合物含有 > 0.25 mM 的 ATP 或 GTP，则用蒸馏水稀释样品。例如，如果 ATP 酶反应含有 1 mM ATP，则在反应结束时，在测定前用水将反应混合物稀释 4 倍。

  • 向各孔中加入 20µL 工作试剂。轻敲微孔板轻轻混匀。

4. 室温下孵育 30 min，显色。

5. 在酶标仪上测定 600 nm-660 nm (620 nm) 处的吸光度。

对于 384 孔板中的测定，程序相同，只是标准品溶液和样品溶液的体积应为 40 L，工作试剂的体积应为 10 L。

 

图。96 孔板磷酸盐标准曲线。孵育 30 min 后，读取 620 nm 处的 OD。数据表示为平均 SD (n = 2)。有效检测范围为 0.02-40 M 磷酸盐。

 

一般考虑

孵育时间。显色反应在室温下 30 min 内完成。在 30 min 时读取 OD 值。

在高浓度磷酸盐 (> 100 M) 或存在高浓度蛋白质和金属（例如）的情况下，可能发生沉淀。

 

 

孔雀绿磷酸盐检测试剂盒

 

如果发生沉淀，在 H2O 中对样品进行系列稀释，运行试验并测定无沉淀孔的稀释因子。使用稀释样品重复测定。

酶反应缓冲液。由于任何外源性游离磷酸盐均会干扰试验，因此确保试验中使用的蛋白制备液、反应缓冲液和实验室器具不应含有游离磷酸盐非常重要。这可以通过向缓冲液中加入工作试剂并测量颜色形成来方便地检查。

液体处置。含量测定混合物含 0.4 M 硫酸。建议在处置前用等体积的 1 NNaOH 中和废液。

 

数据分析

以 OD620 nm 对磷酸盐标准品浓度作图。根据标准曲线测定样品磷酸盐浓度。

 

文献

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高通量筛选

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蛋白质和 DNA 中的磷酸酶、脂肪酶/磷脂、核苷三磷酸酶和磷酸盐分析

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技术说明

孔雀绿磷酸盐检测试剂盒已经过优化和配制，以提供灵敏、方便和稳健的定量测定从酶反应和天然来源中释放的游离磷酸盐。试剂盒的关键特征如下：

试剂非常稳定。由于我们的创新配方，不会发生试剂沉淀。因此，测定前无需过滤试剂，这是其他市售试剂盒的常见要求。

安全。非放射性试验。

高灵敏度和宽检测范围：仅检测 1.6 pmole 磷酸盐和 0.02 M 至 40 M 磷酸盐。

快速方便：均匀的“混合和测量”测定法可在 20 min 内定量测定游离磷酸盐。

与常规实验室和 HTS 格式兼容：可在试管或微孔板、分光光度计和酶标仪上进行测定。

在 96 孔和 384 孔板中观察到稳健且适用于 HTS：Z' 因子为 0.7-0.9。可在 HTS 液体处理系统上轻松实现自动化。