neuroprobe Z02说明书
神经探针Z02
- 一般说明
- 使用Z02的视觉检测，由Sally Zigmond提供
- 故障排除
- 注意和警告
一般说明
在对使用Z02腔室的过程进行一般描述之后，将给出描述该腔室在特定类型的实验中的用途的特定协议。
通常，将一滴悬浮的细胞放在盖玻片的中间。电池粘附后，将干玻璃的末端擦干，在6mm宽的湿部分留有粘附的电池。
将以此方式制备的盖玻片倒置到带凹槽的显微镜载玻片上，以使细胞覆盖部分位于凹槽之间的桥上方。安装夹具后，将细胞悬浮介质和趋化因子吸移到两个凹槽中，直到充满并没有气泡为止。
然后孵育室。
经过适当的时间（取决于细胞类型和实验目标）后，将玻片置于显微镜下，观察并定量细胞的方向。迁移细胞的内部结构也可以通过使用高功率光学显微镜来研究。
使用Z02的视觉检测，由Sally Zigmond提供
- 每次使用前都要清洁腔室。用组织培养清洁剂在温水中洗涤，用蒸馏水冲洗干净并擦干。也可以用70％或95％的ETOH擦拭桥接器。
- 在22mm x 40mm盖玻片的中心放置一滴血（例如，用手指刺）。必须在每个盖玻片上放置足够的血液，以使其凝结并部分缩回而不干燥。每个盖板玻璃大约需要100 µL。
- 将带血的盖玻片放在有或没有CO 2的 37°C的潮湿室内（例如，装有湿滤纸的培养皿中）。
- 大约45分钟后，血液凝结并开始收缩，并且在边缘周围可见液体。此时，可以用0.9％的盐水轻轻冲洗掉血和红细胞。单层细胞（主要是嗜中性粒细胞）保留在盖玻片上。不要让细胞干燥。
- 通过将明胶溶解在沸腾的去离子水中制备10％的明胶原料。加热原料使其熔化，并用已除去碳酸氢盐的Hanks培养基以1:10的比例稀释，并用pH 7.2的HEPES缓冲液（2.40 g HEPES /升）代替。用Hanks稀释时，请确保明胶确实在溶液中。该介质是弱酸性和低渗的。这些条件有助于良好的细胞运动。碱性pH和高渗具有抑制作用。
- 用几滴这种孵育培养基冲洗盖玻片上的细胞层。快速排出盖玻片上的液体，用Kimwipe擦干盖玻片的端部，然后将盖玻片倒置到培养箱中，使细胞位于桥上。
- 将夹子放在玻璃显微镜盖玻片组件的每一侧。不要移动防护玻璃 ; 任何移动都会溶解桥上的细胞。腔室组件需要一些练习。在细胞上的液体少（但不允许细胞干燥）的情况下，盖玻片和桥之间的距离将非常薄；5微米是宜选择（细胞会出现轻微挤压）。如果该间隙太大，则细胞将不能很好地定向。可以使用显微镜的微调旋钮上的千分尺，通过桥顶部和盖玻片底部之间的焦平面差来测量间隙。通过练习，您可以从一侧放下防护玻璃。这有助于消除桥上的气泡；它们会干扰细胞方向。
- 盖好玻璃盖后，用移液管吸取100 µL介质到其中一个凹槽的开口端。用移液管吸取100 µL趋化因子（或阴性对照室的细胞悬浮介质）到另一个槽中。
- 在37°C下孵育约20分钟，以使细胞产生反应。（对于其他细胞类型，可能需要更长的孵育时间。）
- 使用40X相的物镜观察桥上的单元并评估单元方向。方向可以通过细胞形态来评分。运动细胞的前部有宽阔的lamellipodium，而尾巴则较细，可以呈球形或拉入回缩纤维。如果腔室在室温下冷却一段时间，则细胞会聚拢并且更难以刻划。当细胞运动良好时，方向容易得分。
- 方向应在桥的特定位置（趋化剂侧，中间或介质侧）评分。取向水平可以在桥的整个宽度上变化很大，这取决于化学引诱剂的浓度。沿着桥扫描给定的腔室，直到至少刻划了100个细胞。
故障排除
许多伪像可以更改在给定字段中看到的方向级别。
- 与气泡和细胞团相邻的细胞趋于特异。这些因素改变了化学梯度的影响。
- 如果细胞不形成极化形态，则它们可能死在桥上，但在凹槽上还活着。这可能是由于桥脏造成的，或者制备物太薄以至于细胞实际上已经被溶解了。
- 如果细胞形成极化形态但没有定向，请检查桥和盖玻片之间的间隙是否足够薄。如果间隙合适，请尝试使用其他浓度的化学引诱剂。
注意和警告
Zigmond玻璃滑动腔非常脆弱，很容易折断，因此在操作和使用时要格外小心。固定盖玻片的夹具具有可插入显微镜载玻片孔中的销钉。贴合性好，因此要取下它，可能需要在提起夹具时顺时针旋转旋钮。切勿尝试撬开销钉。
腔室配有一个小内六角扳手。如果销钉不太容易拧出，请将其翻转过来，将扳手插入销钉底部的六角孔中，然后将其旋转。与拉动销钉相反，转动销钉可大程度地减少碎玻璃的机会。