ProMap® 初始 CFSE T 细胞增殖检测说明书
绘制幼稚 T 细胞反应的金标准
ProImmune 的 ProMap® T 细胞增殖测定可用于鉴定引发辅助 T 细胞增殖并因此可能引起辅助 T 细胞免疫反应的表位序列。
与基于放射性胸苷掺入的传统测定不同，该测定利用强大的流式细胞术方法，能够准确测定增殖细胞的百分比和 T 细胞反应的详细表型，所有这些都显着提高了整体灵敏度。
为什么选择 ProMap® CFSE 增殖检测？
CFSE 染料稀释是一种久经考验的方法，已在数千份出版物中引用
比放射性检测灵敏得多
流式细胞仪读数可解析要分析的正确细胞群，例如活 CD4+ T 细胞
进一步的子集表型易于添加，并且可以同时读出子集的增殖
整体分析测量增殖时间范围内的所有增殖，而不是在孵育时间结束时的时间窗口内
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主要出版物：
使用英国国防部 (MoD) 的一部分 [dstl] 发布的 ProMap® T 细胞分析验证抗体人源化
图 1比较了抗体的小鼠和人源化 V 区中重叠肽 T 细胞的反应。
O'Brien LM、Goodchild SA、Phillpotts RJ、Perkins SD。
病毒学 (2012) 426(2):100-5。[PMID:22341308]
英国政府国防科学与技术实验室 [dstl] 的科学家使用 ProImmune 的 T 细胞增殖试验来验证他们的抗委内瑞拉马脑炎病毒 (VEEV) 抗体的人源化。序列人源化是将抗体中的动物蛋白序列替换为人源蛋白序列的合理设计方法。然而，这种方法并不能保证得到的生物制品具有低免疫原性。通过使用序列扫描 体外 T 细胞测定，可以生成抗原性数据以显示嵌合序列和人源化序列之间的差异。 在此处阅读完整的案例研究。
ProMap® T 细胞检测和肽/蛋白质疗法
ProMap® T 细胞增殖测定已开发用于识别潜在 T 细胞表位的存在或不存在，可用于新肽或蛋白质的临床前发现。这些分析可以解决结构相似分子之间的“相对免疫原性”问题；例如，它们可以帮助区分不同的候选者，或者可以表明蛋白质工程策略在潜在免疫治疗的去免疫中的成功。
作为 ProImmune 的 REVEAL® 免疫原性系统的一部分， ProMap® T 细胞增殖试验的结果可以与 50 多个 II 类 HLA 等位基因的无细胞 HLA 肽结合试验的结果一起分析。这为客户提供了对一种或多种药物先导的辅助 T 细胞免疫反应的详细资料。
| 图 2： ProMap® T 细胞增殖检测原理。
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用于 20-50 个 HLA 型供体的 PBMC 选自 ProImmune 生物库
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根据项目要求合成肽库
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供体 PBMC 用 CFSE 染料标记。
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每个肽与来自每个供体的 PBMC 共培养。
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CD4+ T 细胞响应肽的增殖导致 CFSE 标记的稀释。
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CFSE 的流式细胞术分析与 CD4 染色相结合，用于定量细胞分裂，并提供抗原性的测量。
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在我们的 Mastering Immunity 2020 会议的这段短片中，Tim Hickling 博士（罗氏免疫安全负责人）描述了如何将 ProMap ® T 细胞增殖检测应用于生物治疗药物的去免疫。
ProMap® T 细胞增殖检测详细信息
细胞用荧光染料 5,6-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 进行标记。那些响应抗原而增殖的细胞显示出 CFSE 荧光强度的降低，这可以通过流式细胞仪直接测量。由于这是一种流式细胞仪检测，它可以准确地确定增殖 CD4+ 细胞的百分比，能够对 T 细胞反应进行详细的表型分析，并且比基于放射性胸苷掺入的传统检测更敏感。
ProImmune 提供两种类型的 T 细胞增殖检测：
用于肽表位作图的 ProMap® T 细胞检测
该测定法用于鉴定可引发辅助 CD4+ T 细胞增殖并因此可能导致辅助 T 细胞免疫反应的肽表位序列，该反应可能导致抗药物抗体 (ADA) 反应或其他不需要的免疫原性。该测定还可用于评估蛋白质序列的有益免疫原性，例如用于免疫疗法的表位发现。
在该测定旨在关注 CD4+ 辅助 T 细胞反应的情况下，CD8+ T 细胞耗尽和 CFSE 标记的供体 PBMC 与 5uM 每种感兴趣的肽一起在六个重复孔中培养 7 天。每个测定板包括一组未经处理的对照孔。该测定还结合了参考抗原对照，包括已知 MHC II 类抗原的合成肽和两种有效的全蛋白抗原。
图 3： 来自初始 T 细胞试验的染色数据示例，(1) CFSE 标记的 T 细胞在培养基中单独培养（未刺激），(2) CFSE 标记的 T 细胞与目标抗原衍生的肽一起培养，(3) CFSE-用对照蛋白 (Tuberculin PPD) 培养的标记 T 细胞。
通过流式细胞仪分析确定细胞增殖。对于 ProMap® T 细胞测定，通过与未刺激样品的结果进行比较，确定每个受刺激样品的高于背景的刺激百分比。每个样本中 CD4+ CFSE 暗淡种群的计数表示为总 CD4+ 种群的比例。六个重复值用于计算高于背景的刺激百分比（有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗细胞的比例，减去没有抗原刺激的 CD4+ CFSE 暗细胞的比例）。
从一式六份的值计算平均值和平均值的标准误差。如果高于背景的百分比刺激大于 0.5% 并且也大于高于背景的 2 倍标准误差，则结果被认为是“阳性”，尽管数据也显示了不太严格的阈值，以允许考虑小响应。
为了允许比较肽， 计算响应指数 。该指数基于将每种肽的反应幅度（高于背景的刺激百分比）乘以每种肽的反应供体数量（抗原性百分比）。
报告中提供的数据是：
图 4： 使用 ProMap® T 细胞增殖测定法测量的抗原性百分比：一组 43 名供体用于测试来自两种治疗性单克隆抗体 Remicade 和 Humira 重链区的肽的潜在免疫原性。每个供体用不同的颜色表示。引起 2 个或更多供体反应的肽被认为值得进一步研究。
图 5： ProMap® T 细胞增殖试验的反应指数：来自与图 3 相同试验的数据——反应指数指示了对测试肽反应的幅度和数量。请注意，PPD 的响应超出了该图的范围。
