Nippon Genetics Bambanker Direct 无血清无需离心细胞冻存液

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Nippon Genetics Bambanker Direct 无血清无需离心细胞冻存液
冷冻保存哺乳动物细胞在生物学研究中非常有价值和普遍。为了防止技术原因（培养操作）使细胞污染或物理原因（培养箱故障）使长期培养功亏一篑。此外，长期多次的培养和传代，导致细胞在遗传学性状上的老化和分化都是促使在接收或生成新细胞系后首要考虑的最佳策略就是冻存细胞。低温冻存对于维持一些特殊细胞株的遗传特性极为重要。细胞深低温保存的基本原理是：在-70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0℃到-20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，冰晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。
如何减少或者避免冰晶形成，如同冻存细菌时用的甘油，DMSO（二甲基亚砜）是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。冻存液中加入后可以使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内的水分逐渐透出，从而减少了冰晶的形成，从而避免细胞的损伤。这就是为什么低温冻存细胞时为什么要采用慢冻的一个重要原因。
一旦从生长培养基转移到冷冻培养基中，就要执行慢冻的过程。尽管冷冻细胞系是通常执行的程序，但是当没有合适的冷冻器具时，或者由于存在血清，额外洗涤或操作不当时，就会出现问题。当然，这个问题是在细胞复苏（快融）后才发现的。发现复苏后的细胞大部分或者全部都是死细胞，甚至还有不容易发现的整个冻存过程的不当导致的细胞分化。所有这些问题和担忧，都可以通过BambankerTM细胞冷冻培养基试剂家族来解决。 BambankerTM的成分允许直接将细胞在-80°C或液氮中冷冻保存，从而避免了对额外设备的需求，并且也避免了耗时且复杂的梯度逐渐冷冻方案。
产品特色

• 可在-80°C或-196°C的温度下长期冻存细胞

• 非常适合杂交瘤细胞和高通量（HTP）应用

• Bambanker Direct可以直接加到细胞中–无需洗涤且无需离心

• 细胞复苏后的活率高

• 即用型冷冻介质–无需程序或顺序降温冷冻

• 无血清–无污染风险

• 保质期长

天生为了杂交瘤（Born for hybridomas）


某些细胞类型（例如杂交瘤）对过度处理和操纵表现出更高的敏感性。 在长期储存和冻融循环后，这些细胞通常表现出更高的死亡率或不想要的分化。 Bambanker Direct正是针对这些类型的细胞而开发的，以提供严格的环境控制。 通过取消离心步骤，现在可以在添加新型冷冻保护剂Bambanker Direct后立即冷冻细胞以长期保存。 只需将Bambanker Direct一对一地添加到培养板孔中，然后直接放入冰箱即可。 与原始Bambanker一样，Direct版本也没有血清，因此对于动物来源的血清可能是一个问题的细胞来说非常有用。 通过使用Bambanker Direct，杂交瘤细胞可在-80°C长期保存后复苏率高达100％。


血清增加了长期储存的差异（Serum adds variation to long-term storage）


所有BambankerTM产品均不含血清。含有血清的冷冻保存培养基具有回收率波动和成分不确定的缺点。冻存于含血清的培养基中的细胞的实验可重复性可能会受到批次之间血清差异的影响，因为蛋白质和其他生物分子的组成和浓度会随每批血清而变化。解冻和使用这种含血清培养基的细胞时，可能会导致问题。因为BambankerTM的每种成分都经过精确定义，因此您可以放心，在不同时间存储的细胞都将有一致的效率。



BambankerTM可防止不期望的分化（BambankerTM prevents undesired differentiation）


不期望的细胞分化也可能是冷冻细胞长期保存的一个问题。 所有Bambanker试剂均旨在大程度地减少此问题。 对于特别麻烦的细胞，Bambanker不含DMSO的配方经过特殊配制，可防止可能与含DMSO的冷冻保存试剂相关的问题。 因此，请加入越来越多的实验室的选择，使用Bambanker保护其细胞系！


多能干细胞的细胞活力和ALP染色 

                    上排：解冻两天后检测到大量细胞。 解冻后细胞没有形态变化 

                    下排：BambankerTM不会引起细胞分化，因为所有冻结的干细胞仍会产生高水平的碱性磷酸酶，这是多能干细胞的报告基因

细胞冻存液家族（Family of BambankerTM）


Bambanker 细胞冻存液-细胞冻存、解冻操作步骤


✔冻存操作步骤：慢冻


①从细胞培养箱中取出培养中处于对数增殖期的细胞。※冻存对数增殖期的细胞，是可以确保细胞良好生存率中最重要的一点。 

②使用部分细胞用台盼蓝染色（检测活率）并计数细胞数量。 

③将含细胞的培养基移至离心管中，在合适条件（低离心力，必要低温）下进行离心。 

④去除上清液后，将细胞沉淀通过轻柔旋涡操作进行悬浮。 

⑤每个冻存管中细胞数要保持规定浓度，然后再添加冻存液。 （每 1mLBambanker冻存液可冻存 5×105～1×107 个细胞）※⑤之后的操作步骤尽可能快速完成。另外，Bambanker冻存液从冷藏柜取出后，直接使用，无须平衡室温，尽快进行保存处理 。

⑥无需预冷细胞悬浮液，直接置于-80℃下保存。 

⑦保存液氮时，先在-80℃保存 12 小时（超过一晚），待状态稳定后在移至液氮中保存。※转移细胞时请尽快完成操作。 


✔解冻操作步骤：快融 

①在 37℃恒温箱（或者37℃水浴锅）等设备中解冻细胞，确认冻存管中液体融解。※此操作需迅速进行。因为细胞在解冻过程过极易受到损坏。

②将溶解的细胞液转移到含有培养基的15ml无菌离心管中，混合后在规定条件下进行离心 （比如：300～400×g） 

③去除上清液后，加入少量培养基，将细胞沉淀通过轻柔旋涡操作进行悬浮。 

④混匀后，取出其中一部分细胞用台盼蓝染色（检测活率）并计数细胞数量。

⑤将混匀的细胞悬液转移至培养容器中，细胞培养箱内静置培养。


常见问题（FAQ）


Q1. Bambanker冻存液可以使用的最小体积是多少？


对于1*106个细胞，建议使用1 mL，对于较少的细胞，您可以减少Bambanker的用量。 例如，对于5×105，请使用0.5 mL。


Q2. Bambanker冻存液是否包含DMSO？


除Bambanker DMSO-Free（BBF01）外，Bambanker的其他三种均包含DMSO。


Q3. 复苏培养时，我们可以在不进行细胞洗涤的情况下直接在培养基中使用解冻的细胞吗？

 是的，您不需要清洗步骤。


Q4. 可以将在Bambanker中冷冻的细胞用于提取RNA吗？

可以。 但是请注意，每个试管中的细胞数少（1*106个细胞）可能会导致分离出的RNA少。


Q5. 我们可以使用Bambanker进行PBMC的冷冻保存吗？

可以，


PBMC冻存的一个案例：

实验方案：

i）从健康人的血液中分离出PBMC

ii）PBMC在Bambanker（标准版）中冷冻，并在-80°C和-196°C（液氮）中以1×10 ^ 6细胞/个保存12个月。 1mL Bambanker 1mL等分试样

iii）冷冻后十二个月，快速融化细胞并测量细胞数，然后使用包被抗CD3抗体的T-25培养瓶和含IL-2（700 U / mL）的培养基培养7天。在第5、6和7天测量细胞计数，并在培养的第7天进行流式细胞术。

实验结果：

在-80°C下保存12个月，回收率59.5％；存活率88.9％

储存在液氮中（-196°C）保存12个月，回收率63.9％；存活率87.3％

回收率=解冻后完整细胞数/最初冻存的细胞数；存活率=在设定的检测时间点，通过台盼蓝测定的活细胞在总细胞中所占的百分比。


Q6. 您建议如何处理特别脆弱/敏感的细胞？

冷冻技巧：冷冻敏感细胞的最佳方法是将细胞放入Bambanker（选择合适的类型）中，并在处理过程中将其保持在4°C。将它们尽可能快地放入-80°C的冰箱中24h。然后，将细胞储存在-80°C或将冷冻的细胞转移至液氮中。

解冻技巧：将小瓶放入37°C水浴中，直到内容物融化为止。然后应立即将细胞转移至大量预热的培养基中-对于最敏感的细胞类型（干细胞，原代细胞），逐滴添加以保持活力。尽管某些细胞可以通过离心沉淀，然后再用移液器轻轻重悬，然后添加到装有预热生长培养基的细胞培养瓶中，但对于大多数敏感细胞类型，将它们融化后直接移入培养瓶中的操作更为温和。第二天进行培养基更换，以除去任何残留的防冻剂。


Q7. 我们可以使用Bambanker冷冻保存整个类器官吗？

是的，Bambanker和Bambanker HRM是您的选择。 两者均可提供超过70％的恢复率。 我们建议每个冷冻管使用少量类器官（低于20 mg）。 我们还建议您先将类器官在4°C的Bambanker中浸泡10分钟，然后再冷冻。 将正常Bambanker用于类器官，将Bambanker HRM用于人类临床试验或人类组织衍生的类器官。


Q8. Bambanker可以用于果蝇吗？

只要是冻存单个细胞，就没有问题。 我们没有冻存整个生物体的经验。


Q9.我可以使用Bambanker冻存受感染细胞中的病毒吗？

只要细胞保持健康，这没问题。


Q10. 我可以直接使用Bambaker而不用将其恢复室温（RT）吗？

没问题，可以直接使用。


Q11. 如何使用Bambanker提高类器官的生存率？ 我们使用20毫克的胃和结肠组织。

您可以将正常Bambanker用于动物组织。 另外，我们建议将组织细化到20毫克以下。 您也可以在冷冻之前将组织在4°C的Bambanker中浸泡10分钟。


Q12. 为什么我使用了Bambanker来保存细胞，但是存活率依然不高？

请冻存前确保细胞处于生长对数期，并且冻存时细胞数目控制在5×105~1×107/mL冻存液。


Q13. 我们实验室已经有固定的冻存程序了，如果换了你们的Bambanker，可以还继续用原来程序降温的方法冻存吗？

虽然本产品可以无需程序降温冻存细胞，但如果通过程序降温盒等适当控制了温度下降的速度，效果更佳（如虎添翼）。


Q14. 哪些细胞株（系）适合使用Bambanker来进行细胞冷冻保存？

几乎所有细胞株（系）都可以使用Bambanker进行冻存。对于较为宝贵的ES/iPS细胞的保存尤其适用。上所列举的细胞系均已经过测试验证。

但也并不排除可能有某些细胞株是不适合使用Bambanker来进行冻存的，用户在没有确认是否可使用时，建议在进行细胞冻存之前先进行预实验。


Q15. 无血清冻存液相比传统含血清冻存液有什么优势？

无血清冻存液因不含有动物血清，质量更稳定，批间差更小；同时未知生物成分或感染性物质污染细胞的几率也极低，尤其对于ES/iPS细胞等有可能用于再生医疗的细胞安全得以严格保障；可以直接冻存无血清培养的细胞，免去无血清再驯化的步骤；另外Bambanker无血清细胞冻存液不需要像传统的血清冻存液那样需要程序降温，减少了用户的繁琐操作，节省了时间。


Q16. Bambanker在冷冻保存细胞的过程中起什么作用？

无血清细胞冻存液使用了DMSO（DMSO-Free除外）等作为保护剂，在冻存细胞时能以1℃/min左右的温度下降而逐渐冻存，在此过程中，细胞内的水分子被置换成保护剂，抑制胞内和细胞周边的冰晶的形成，防止细胞膜和细胞器结构损伤，防止蛋白变性。