T7 RNA聚合酶|T7 RNA polymerase(50 U/μL)
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FAQ
COA
已发表文献
本产品是大肠杆菌重组表达来源的噬菌体T7 RNA聚合酶，以含有T7启动子序列（5’-TAATACGACT CACTATAG*-3’）的双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的反向单链DNA互补的RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。
注：G*为RNA转录的第一个碱基。
产品组分
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编号 |
组分 |
产品编号/规格 |
||
|
10618ES90 (5000 U) |
10618ES96 (25000 U) |
10618ES97 (50000 U) |
||
|
10618-A |
T7 RNA polymerase (50 U/μL) |
100 μL |
500 μL |
1 mL |
|
10618-B |
10×Transcription Buffer |
400 μL |
1 mL ×2 |
1 mL ×4 |
注：10×Transcription Buffer中含460 mM MgCl2和100 mM DTT，但不含有NTP，如需请购买本公司NTP set solution 10133。
产品应用
1. 单链 RNA合成（包括mRNA，siRNA，gRNA等各类RNA前体，以及同位素标记或非同位素标记的RNA探针）
2. 以（Cap analog）为引物合成Capped mRNA
酶活定义
在 37℃、pH8.0 的条件下，1h内使1 nmol 的 [3H] GMP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位。
运输和保存方法
干冰运输。-20℃保存，有效期一年。
质量控制
核酸外切酶残留检测：100 U的本酶和0.5 μg λ DNA-Hind III酶切产物37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
切口酶残留检测：100 U的本酶和0.5 μg IL23R质粒，37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带无变化。
RNase残留检测：100 U的本酶和0.5 μg 293T细胞总RNA，37℃下孵育4 h，RNA的电泳谱带无变化。
注意事项
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 本产品仅做科研用途！
应用实例
按下列体系配制反应体系
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
|
10×Transcription Buffer (Mg2+ Plus) |
2 |
1× |
|
CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) |
0.4 each |
2 mM each |
|
T7 RNA Polymerase (50 U/μL) |
0.5-1 |
– |
|
RNase inhibitor (40 U/μL) |
1 |
– |
|
RNase free H2O |
Up to 18 |
– |
|
模板DNA |
2 (100 ng-1μg) |
– |
注： 1. DNA模板需要最后加入。由于10×Buffer中含有亚精胺，亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。
2. Buffer和水建议放置到室温，然后开始使用，反应于室温下配制，防止温度低引起亚精胺沉淀高浓度DNA模板。
3.若转录长度< 100 nt，模板投入量可增加至2 μg。
4. RNase inhibitor (40 U/μL)请购买本公司产品10603。
5.为了特定区域的有效转录，建议在其区域下游把模板DNA预先切成平端或5′突出末端。
37℃反应1-2 h（若转录长度≤ 100 nt，增加时间至4-8 h）。
反应结束后，使用2 U DNaseⅠ（无RNase）37℃ 15分钟去除DNA模板。
转录产物纯化：体外转录产物可选用RNA Cleaner磁珠进行纯化（12602），以去除蛋白、盐离子和其他杂质。也可以采用酚/氯仿纯化法（具体操作步骤可联系Yeasen索取）。
操作建议
1.DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。
2.转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RNase A会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板；PCR产物建议采用胶回收纯化后使用。
3.在20 μL反应体系中加入0.02 U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量。
HB220118
本产品是大肠杆菌重组表达来源的噬菌体T7 RNA聚合酶，以含有T7启动子序列（5’-TAATACGACT CACTATAG*-3’）的双链DNA为模板，以NTP为底物，合成与启动子下游的反向单链DNA互补的RNA。双链线性平末端或5’突出末端DNA均可作为T7 RNA聚合酶的底物模板，因此线性质粒、PCR产物均可用作体外合成RNA的模板。
注：G*为RNA转录的第一个碱基。
产品组分
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编号 |
组分 |
产品编号/规格 |
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10618ES90 (5000 U) |
10618ES96 (25000 U) |
10618ES97 (50000 U) |
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10618-A |
T7 RNA polymerase (50 U/μL) |
100 μL |
500 μL |
1 mL |
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10618-B |
10×Transcription Buffer |
400 μL |
1 mL ×2 |
1 mL ×4 |
注：10×Transcription Buffer中含460 mM MgCl2和100 mM DTT，但不含有NTP，如需请购买本公司NTP set solution 10133。
产品应用
1. 单链 RNA合成（包括mRNA，siRNA，gRNA等各类RNA前体，以及同位素标记或非同位素标记的RNA探针）
2. 以（Cap analog）为引物合成Capped mRNA
酶活定义
在 37℃、pH8.0 的条件下，1h内使1 nmol 的 [3H] GMP 掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位。
运输和保存方法
干冰运输。-20℃保存，有效期一年。
质量控制
核酸外切酶残留检测：100 U的本酶和0.5 μg λ DNA-Hind III酶切产物37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
切口酶残留检测：100 U的本酶和0.5 μg IL23R质粒，37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带无变化。
RNase残留检测：100 U的本酶和0.5 μg 293T细胞总RNA，37℃下孵育4 h，RNA的电泳谱带无变化。
注意事项
1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 本产品仅做科研用途！
应用实例
按下列体系配制反应体系
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组分 |
体积（μL） |
终浓度 |
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10×Transcription Buffer (Mg2+ Plus) |
2 |
1× |
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CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) |
0.4 each |
2 mM each |
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T7 RNA Polymerase (50 U/μL) |
0.5-1 |
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RNase inhibitor (40 U/μL) |
1 |
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RNase free H2O |
Up to 18 |
– |
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模板DNA |
2 (100 ng-1μg) |
– |
注： 1. DNA模板需要最后加入。由于10×Buffer中含有亚精胺，亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。
2. Buffer和水建议放置到室温，然后开始使用，反应于室温下配制，防止温度低引起亚精胺沉淀高浓度DNA模板。
3.若转录长度< 100 nt，模板投入量可增加至2 μg。
4. RNase inhibitor (40 U/μL)请购买本公司产品10603。
5.为了特定区域的有效转录，建议在其区域下游把模板DNA预先切成平端或5′突出末端。
37℃反应1-2 h（若转录长度≤ 100 nt，增加时间至4-8 h）。
反应结束后，使用2 U DNaseⅠ（无RNase）37℃ 15分钟去除DNA模板。
转录产物纯化：体外转录产物可选用RNA Cleaner磁珠进行纯化（12602），以去除蛋白、盐离子和其他杂质。也可以采用酚/氯仿纯化法（具体操作步骤可联系Yeasen索取）。
操作建议
1.DNA模板的种类：推荐使用含T7启动子的线性化质粒和PCR产物作为模板。
2.转录模板的纯度会显著影响体外转录反应。在质粒DNA抽提过程中残留的RNase A会显著影响转录RNA的质量。通过酚-氯仿抽提的质粒DNA为最佳模板；PCR产物建议采用胶回收纯化后使用。
3.在20 μL反应体系中加入0.02 U热稳定无机焦磷酸酶可显著提高转录产量。
HB220118
Q:如何获得特定长度的 RNA 呢？
A:可以在插入位点下游选择限制酶切割，切割产生平末端或 5-突出端最好。
Q:T7 转录酶有没有验证过除 37℃外其他温度下的活性？
A:37℃和 42℃转录能力无差别，但是不耐 50℃。
Q:转录产物有杂带（偏大）是什么原因？
A:模板线性化不完全，导致转录停不下来，所以转录条带会偏大，出现杂带。
Q: T7酶的保真性能怎么样？有没有开展相关测试？
A: 我们的T7酶测试了相对保真度，与Thermo的保真度差不多，大概万分之四的突变率。目前野生型的T7保真度都差不多，基本能满足客户的需求。现项目中没有更高保真度T7的开发计划。
Q: 使用T7聚合酶的产量是使用LiCl纯化后进行测定的吗？有没有A260/280和A260/230的数据？
A: 是通过LiCl纯化后进行测定的，我们有记录过相关数据A260/280大概比值再在2.0-2.1之间；使用我们的羧基磁珠纯化也基本在这个范围以内。具体数据可以整理之后再分享。
Q: 采用T7聚合酶转录的时候，有没有什么办法，减少polyA尾多转录的问题？
A: 这一情况是T7反应体系的自身特性，无法完全避免。根据相关的文献，控制mRNA自延长的思路主要还是两方面：
①对模板3'末端上游序列进行优化；
②控制IVT产量，高产量下自我延伸的几率会更高。
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