产品描述

Annexin V-Alexa Fluor647/PI细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-Alexa Fluor647/PI Apoptosis Detection Kit）是用Alexa Fluor647标记了的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

另外，本试剂盒中还提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Alexa Fluor647 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

本试剂盒需要使用流式细胞仪进行检测。

产品组分

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。-20 ℃避光保存，避免反复冻融，一年有效期。

【注】：如果需要在短时间内多次重复使用，可以在4 ℃避光保存，半年有效期。

注意事项

1、由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。

2、对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-Alexa Fluor647的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

3、如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。

4、试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

5、Annexin V-Alexa Fluor647和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。

6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7、本产品仅作科研用途！

使用说明

1、 样品染色

1.1、悬浮细胞：300 g，4℃离心5 min收集细胞。

贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。1.2、用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5 min。

1.3、吸弃PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞。

1.4、加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 647和10 μL PI，轻轻混匀。

1.5、避光、室温反应15 min。

1.6、加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

【注】：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

2、流式细胞仪分析

Alexa Fluor647最大激发波长为651 nm，最大发射波长为667 nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），Alexa Fluor647为横坐标，PI为纵坐标。每个样采集10,000 events。

HB220222

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Q：染色结果可以使用多功能酶标仪观察吗？

A：可以，建议如果条件允许最好是使用荧光显微镜或是共聚焦显微镜 流式仪器。

Q：染色后多久进行？

A：建议染色后应立即进行观察，应当在 30min 内完成整个实验观察过程。

Q：染色工作液使用什么溶液进行配置？

A：如果试剂盒内提供有稀释 buffer，应使用该溶液配置，如果没有配备，可以使用 HBSS 无血清培养基 PBS 等合适的缓冲液进行配置。

Q：染色时添加多少体系的工作液进行染色？

A：如果是爬片观察，添加的剂量应是尽量浸没细胞为宜，如果采用流式观察使用剂量可以参考说明   书建议的用量。

Q：40307 Tunel 细胞凋亡检测的可以应用到植物或是细菌（原核生物）吗？

A：可以，但是需要制备原生质体，因为植物细胞或是细菌（原核生物）含有细胞壁，具体的染液使   用剂量只需浸没细胞即可，染色时间对于不同细胞有一定的不同。

Q：40307 Tunel 细胞凋亡检测，细胞爬片好凋亡处理后需要在固定通透吗？

A：需要通透，因为 TdT 酶需要经过通透的细胞才能进入细胞内，而 Annexin V 和JC-1 是不能进行染

色固定的。

Q：Tunel 细胞凋亡检测时，贴壁细胞必须要先消化下来再染色吗？

A：不需要，对于贴壁细胞，要先用 PBS 洗 2-3 次，然后直接用多聚甲醛固定细胞，在通透处理，染

色观察。

Q：可以通过那些仪器检测tunel 荧光信号？

A：荧光显微镜 共聚焦显微镜 流式细胞仪 酶标仪均可以检测tunel 荧光信号。

Q：Tunel 检测在实验操作上有哪些注意事项？

A：荧光基团长期暴露在普通光照下，会发生严重淬灭现象，因此在实验操作上应尽量避光操作和孵育。

Q：0：Tunel 检测除了多聚甲醛固定，可不可以使用甲醇固定？

A：使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。酸性固定液，也容易导致假阳性的出现。建议采用新鲜配置的 4%中性多聚甲醛固定液。

Q：1：试剂盒的保质期多久？

A：对于探针类的试剂在规定的保存条件下保质期是一年左右。

Q：2：荧光显微镜检测时发现荧光较弱，怎么办？

A：对于荧光较弱的情况可以适当的增加孵育时间和工作液浓度，对于细胞也尽量选择状态较好的细   胞进行染色观察。

Q：3：为什么我激发后荧光很快就猝灭了？

A：可能是使用浓度过高造成，可以再适当降低一些试剂浓度；可以在寻找视野时使用低能量的激光，

待找到合适视野时使用高能量激光激发观察；或者是使用抗猝灭剂。

Q：两个试剂的浓度分别是多少？

A：AnnexinV浓度时0.4mg/ml，PI浓度时20ug/ml