3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值，制作出一条以细胞数量为横坐标（X轴），OD值为纵坐标（Y轴）的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量（使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。）

二. 细胞活性检测

1、在96孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔）。将培养板放在培养箱中预培养一段时间（37℃,5% CO₂）。

2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

3、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

4、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

三. 细胞增殖-毒性检测

1、在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。将培养板放在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO₂）。

2、向培养板加入10 μL不同浓度的待测物质。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24或48小时）。

4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育1-4小时。

6、用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

7、若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

活力计算

细胞活力*（％）=[A(加药)-A（空白）]/[A（0加药）-A（空白）] ×100
A（加药）：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A（0加药）：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项

1）建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

2）有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。

3）白细胞可能需要培养较长时间。

4）当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

5）如果没有450 nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。

6）培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

7）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

HB230302

时间由 2 小时缩短为 1 小时。此外，可适当减少细胞的数量。太低可以采取 2 个办法： 1、适当增加细胞数量 2、延长加入CCK-8 试剂后的反应时间。

Q：哪些物质会影响 CCK-8 的实验测定结果？

A：当培养体系内含有还原性物质存在时会还原 WST-8，从而使 OD 值增加；当有氧化性物质存在时会抑制还原反应进而使 OD 值减小。

Q:做细胞毒性实验，我的细胞都死了，为什么我加入CCK8试剂后检测的OD值和对照组OD值差不多？

A:①细胞凋亡或者死亡之后乳酸脱氢酶被释放到细胞培养液中，可以长期存在，从而导致检测的OD值偏大。再次说明细胞的活性和OD值并不能完全划等号。建议客户在加入CCK8的时候更换新的培养基，确保得到准确的结果。

 ②加入细胞中的检测药物是还原性的，从而导致OD值偏高。建议加入CCK8的时候更换新的培养基。

Q：对照组（培养基+CCK8）的值很高，是为什么呢？

A：可以测一下培养基是否含有氧化还原物质，可能是培养基中的物质引起的。

Q:  细胞不贴壁可以测活性吗？预培养是必须的吗？

A: 需要预培养，如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养 ，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。若不做细胞预培养，需在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。

Q: CCK-8能否检测细菌细胞？

A: 可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。向100μl E.coli培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。

Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

CCK-8法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测等。

保存条件

冰袋运输，-25~-15℃避光干燥保存，有效期2年。

CCK-8方法的优势

1）表1 CCK-8法与其他细胞增殖/毒性检测方法的优势比较

2）酚红和血清对CCK-8法的检测不会造成干扰；

3）细胞毒性非常低，因此加入WST-8显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。

CCK-8试剂盒操作说明

一. 制作标准曲线（测定细胞具体数量）

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞到培养板内。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每个浓度建议

Q：CCK-8 的保存和稳定性如何？

A：CCK-8 稳定性高，避光条件–20℃有效期 2 年，4℃有效期 1 年。经常使用建议 4℃ 保存，避免反复冻融。CCK 正常颜色为粉红色，若颜色发生明显偏差，质量可能有发生变化。

Q：CCK-8 的细胞毒性如何？

A：CCK-8 毒性非常低，因此 CCK-8 检测完后相同的细胞还能用于其它细胞增殖检测如结晶紫染色法，中性红染色法或 DNA 荧光染色法。

Q：CCK-8 会对活细胞进行染色吗？

A：不会，首先 WST-8 不会进入细胞染色，整个显色反应都是在培养体系中进行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都属于高度水溶性组分，反应结束更换新的培养液，即可清除外源组分。因为 CCK-8 是基于 WST-8 能够被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色甲臜产物（Formazan）的原理研制开发的，因而不会对细胞进行染色。

Q：培养基的本底颜色如酚红会不会影响细胞活性的检测呢？

A：不会的，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

Q：在加入 CCK-8 时可否不更换培养基？

A：一般情况下可以不更换培养基。但是如果培养基里有氧化还原性物质的话，有可能会产生误差，必须更换其它培养基。

Q：在实验中OD 值太高或者太低，怎么解决？

A：太高可以缩短加入CCK-8 后的培养时间。例如：可以把加入CCK-8 试剂后的培养