细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。常用的检测细胞增殖方法是BrdU法。EdU法检测是Brdu方法的升级和突破。EdU（5-溴-2-脱氧尿嘧啶）是一种嘧啶类似物，可在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测是基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃的原子共价反应。

试剂盒中EdU试剂含有炔烃，而Yefluor 594 Azide染料试剂含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。只需少量的叠氮化染料即可有效地标记出整合的EdU。标准化的戊二醛固定和去污剂促渗可以使检测试剂进入细胞，而Brdu方法则需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）去暴露BrdU从而方便BrdU抗体结合。

本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组份，可以检测细胞增殖与细胞周期分析，适用于荧光显微镜和流式细胞仪检测。对于细胞周期的分析，试剂盒提供了细胞核染料Hoechst 33342。

 

产品信息

货号	40276ES60 / 40276ES76
规格	100 T / 500 T（适用于荧光显微镜）；或10 T / 50 T（适用于流式细胞仪）
光谱特性	Yefluor 594 Azide：Ex/Em=594/617 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461nm, bound to DNA
适用设备	荧光显微镜；流式细胞仪

 

组分信息

组分编码	组分名称	40276ES60 (100 T / 10 T)	40276ES76 (500 T / 50 T)
40276-A	10 mM EdU	0.2 mL	1 mL
40276-B	Yefluor 594 Azide	50 µL	250 µL
40276-C	10× Click-iT EdU反应缓冲液	1 mL	5 mL
40276-D	CuSO4	0.5 mL	2×1.25 mL
40276-E	Click-iT EdU缓冲液添加物	30 mg	150 mg
40276-F	Hoechst 33342	25 µL	125 µL

 

储存条件

-25~-15℃避光储存，有效期1年。开封后，组分A（10 mM EdU）需-25~-15℃储存，组分B（Yefluor 594 Azide）需-25 ~-15℃避光储存，其余组分2-8 ℃存储即可。

 

使用说明

荧光显微镜检测方法

1.其他所需试剂

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛 in PBS ）

2 mg/ml 甘氨酸溶液（去离子水配制）

促渗试剂（0.5% Triton X-100 in PBS）

3% BSA in PBS, pH 7.2-7.6

去离子水

18×18 mm 盖玻片

2. EdU标记细胞

注意：EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐客户以10 μM的EdU初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。预实验中我们建议客户设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。

1）以每孔4×10³-1×10⁵细胞接种于96孔板中，进行您所需要的药物处理或者其他刺激处理。

2）准备一份2×的EdU工作液（组分A）：以完全培养基稀释10 mM的储液至合适的工作浓度。建议您以10 μM的初始工作浓度开始预实验。

3）预热2×的EdU工作液，加入等体积的培养基，使浓度变为1×(如：需要得到10 μM的终浓度，应以新鲜培养基等体积加入到20 μM的EdU工作液中)。

4）合适时间合适条件孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

3. 细胞固定及促渗操作

1）孵育完成后，去除培养基加入50 μL 4%中性多聚甲醛至各个孔，室温孵育15-30 min后，去除固定液。

2）每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，中和残留的固定液。

3）以每孔0.1 mL 3% BSA in PBS的洗涤液洗涤细胞2次。

4）去除洗涤液，加入0.1 mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每个孔中，室温孵育20 min。

注意：本参考步骤是针对以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促渗操作样本而优化的操作方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等。

4. EdU检测

注意：本参考步骤每孔反应使用100μL的Click-iT反应混合物。用户可根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。

1）准备1× Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）：10×组分C试剂以去离子水稀释10倍即可。

2）制备一份5×的Click-iT EdU反应添加物储液（组分E）：加0.3 mL去离子水至30 mg的E组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用）。

3）准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5×储液（组分E）至1×，溶液应新鲜配置，当天用完。

4）依据表1准备Click-iT反应混合物。表1要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

表1.用于荧光显微镜检测的Click-iT反应混合物

组分名称	以10个孔的样本数为例
1× Click-iT EdU反应缓冲液（组分C）	855 µL
CuSO4 （组分D）	40 µL
Yefluor 594 Azide（组分B）	5 µL
1×反应缓冲液添加物（步骤4.3所准备）	100 µL
总体积	1 mL

5）去除促渗剂，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗涤液洗涤2次，去除洗涤液。

6）加入0.1 mL Click-iT反应混合物至每个孔，简短摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖细胞。

7）室温避光孵育30 min。

8）除去反应混合物，每孔以0.1 mL 3% BSA in PBS洗涤两次，去除洗涤液。

对于核染色，可以进行DNA复染。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

5. DNA复染（可选）

1）以0.1 mL PBS洗涤每孔1次，去掉洗涤液。

2）以PBS稀释Hoechst 33342（组分F）储液1:2000至1× Hoechst 33342溶液，终浓度为5 µg/mL。

3）每孔加0.1 mL 1× Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15-30 min。除去Hoechst 33342溶液。

4）0.1 mL PBS洗涤每孔2次，去除洗涤液。

流式细胞仪检测方法

6.其他所需试剂

10 mM PBS, pH 7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛in PBS ）

促渗试剂（0.5% Triton X-100 in PBS）

1% BSA in PBS, pH 7.4

7.EdU标记

注意：EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐客户以10 µM的EdU初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。预实验中，我们建议客户设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。

1）按每孔1×10⁵~3×10⁶个细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段。进行您所需要的药物处理或者其他刺激处理。

2）EdU加入细胞培养基至所需的浓度混匀，推荐客户以10 μM的EdU初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。

3）以合适时间和条件孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

注意：EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(< 2 h)宜采用高浓度，如：10~50 μM，长时间孵育( >24 h)宜采用低浓度，如：1~10 μM。

8. 细胞固定及促渗操作

1）孵育完成后，收集细胞，1% BSA in PBS清洗细胞1次，离心收集细胞。

2）100 µL 4%多聚甲醛in PBS重悬细胞。

3）室温避光孵育15 min。

4）1% BSA in PBS的洗涤液洗涤细胞2次。

5）0.1 mL 0.5% Triton X-100促渗液重悬细胞，室温孵育20 min。

注意: ①本参考步骤是针对以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促渗操作样本而优化的操作方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等等。

②对于需要同时做细胞表面抗原标记的实验，可以考虑在完成EdU孵育后，以含1% BSA-PBS洗涤2次细胞后，在细胞固定促渗之前进行。

9. EdU检测

1）制备一份5×的Click-iT EdU反应添加物储液（组分E）：加1 mL去离子水至100 mg的E组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤ -20 ℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用）。

2）准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5×储液（组分E）至1×，溶液应现用现配，当天用完。

3）准备1× Click-iT EdU反应缓冲液: 10×Click-iT EdU反应缓冲液 (组分C) 以去离子水稀释10倍即可。

4）依据表2准备Click-iT反应混合物。

注意：表2要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

表2. 用于流式细胞仪检测的Click-iT反应混合物

组分名称	每单次反应所需的加液体积
1× Click-iT EdU反应缓冲液（步骤9.3所准备）	875 µL
CuSO4 （组分D）	20 µL
Yefluor 594 Azide（组分B）	5µL
1×反应缓冲液添加物（步骤9.2所准备）	100 µL
总体积	1 mL

5）加入1 mL Click-iT反应混合物至每管，混匀。

6）室温避光孵育反应混合物30 min。

7）以1% BSA in PBS洗涤细胞一次，收集细胞去除上清，以1 mL含1% BSA的PBS重悬细胞，上机检测。

 

注意事项

1.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2.本产品仅作科研用途！

 

Ver.CN20230525

Q: 为什么标记样品无信号或特异性信号非常低？如何提高信号？

A:

1. 请保证试剂使用时为无色的状态，不要使用已经变黄的添加剂或缓冲液；
2. 为确保 Click 反应试剂能够到达核内，细胞需要充分地固定和通透；
3. 由于铜离子能结合到部分试剂上，这会导致催化 Click 反应的有效浓度降低。所以在 Click 反应前，不要在任何缓冲液或试剂中引入金属螯合剂（例如 EDTA、EGTA、柠檬酸盐等），对某些含有这些物质的实验样品来说，进行Click 反应前，可能需要增加额外的洗涤步骤；
4. 当铜离子在合适的化合价时，Click 反应才有效。Click 反应中用到的铜离子为二价铜(Cu2+)。
5. 延长Click 反应的时间至超过 30 分钟也并不会提高信号。建议使用新鲜的Click 反应试剂再次进行 30 分钟的孵育，可更有效地提高标记效率。

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Q:可以做体外吗？客户样本是组织。细胞样本可以吗？

A: 体外是可以，但是组织不可以，必须要保证能增殖，有DNA 合成。能进行增殖的细胞就可以。

Q: EdU 和Brdu 检测区别？

A: BrdU 免疫检测需要变性DNA 后才能与抗体结合，而 EdU 因为其特有的炔羟基团可以与一些荧光染料发生“Click”化学反应，无需变形，从而将细胞标记上荧光，因此应用更广泛。

Q:能否在活细胞中进行 Click-iT EdU 检测？

A: 不可以。虽然 EdU 是对活细胞进行代谢标记，但是叠氮化物检测试剂和缓冲液组分是细胞非透过型，检测信号时的Click 反应必须在固定和通透的样品上进行。

Q: 观测到较高的本底干扰，这是什么原因所致？如何减少本底干扰？

A: 叠氮化物和炔烃类间 Click 反应非常有选择性，生物体内几乎不可能有副反应发生，所以本底较高一般是由洗涤不充分造成的。减少本底干扰的最佳方法是增加BSA 洗涤的次数。同时， 也可在同样的检测条件下设置一组同等处理的无染料或无Click 反应对照，以排除自发荧光干扰。此外，您还可在无 EdU 体系中进行完整的 Click 反应，验证Click 反应信号的特异性。