该试剂盒可以将Illumina试剂盒构建的双链线性文库转化为兼容华大智造测序平台的环状ssDNA文库。构建的文库可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 进行测序。

 

产品组分

组分编号与名称			13342ES16	13342ES96
13342-A		AC-PCR Amplification mix	400 μL	2×1200 μL
13342-B		AC-PCR Primer mix	16 μL	96 μL
13342-C		App-A Splint Buffer	240 μL	2×720 μL
13342-D		Ligase	80 μL	480 μL
13342-E		Digestion Buffer	130 μL	780 μL
13342-F		Digestion Enzyme	32 μL	192 μL

 

运输与保存方法 

干冰运输。

所有组分-20°C保存，有效期1年。

*当运输条件、储存条件及使用方式都正确时，所有组分在有效期内均能保持完整活性。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、样本要求及处理

2.1样本要求

样本为线性dsDNA文库，接头序列符合下列之一：

单index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

双index：

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

线性dsDNA文库插入片段范围为 100 ~ 500 bp，同时主带集中在±100 bp 以内。

2.2 样本量要求

 根据文库总量选择合适的线性dsDNA投入量，详见表1：

表1  线性dsDNA总量与浓度要求

线性dsDNA文库投入量(ng)	线性dsDNA文库总量(ng)	线性dsDNA文库浓度要求(ng/μl)
10	≤25	＞0.45
25	25＜文库总量＜50	1＜文库浓度＜2.1
50	＞50	＞2.1

2.3 转换PCR

不同线性 dsDNA 文库投入量，所需 PCR 循环也不相同，详见表2：

表2  不同线性dsDNA投入量PCR循环数推荐表

线性dsDNA文库投入量(ng)	推荐PCR循环数
10	8
25	7
50	6

2.4 转换文库pooling要求

1. 不推荐在转换PCR前对线性dsDNA进行pooling。

2. 需将接头转换 PCR 产物混合测序，则 Sample Barcode Pooling 应遵循碱基平衡的原则：最佳平衡状态 ATGC 4种碱基的占比应分别为 25% ，若不能达到 25%，则要保证每个 cycle 都存在 ATGC 四种碱基序列，并且最少的碱基不应低于 12.5%，最多的碱基不应高于 62.5%。

3. 不同片段长度的文库不建议 pooling 环化。

4. 若样本所需数据量相同且长度相同，则可以等量混合，每个样本所需的质量按照公式1进行计算：

公式1混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量 (ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量 (ng）/混合的样本个数 N

5. 混合后接头转换 PCR 产物总量为 1 pmol，总体积最多为 40 μL；若文库不足则用 TE buffer补充至 40 μL

三、关于磁珠纯化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检（Library Quality Analysis）

1. 转换文库推荐使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等双链 DNA 进行定量， 要求最终接头转换 PCR产物的摩尔产量至少为 1 pmol，可根据公式2计算或参考表2。

公式2 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表3  不同片段大小PCR产物1 pmol对应产量

PCR产物主片段大小（bp）	1 pmol对应产量（ng）
300	198
350	231
400	264
450	297
500	330

2. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  
3. 单链环状 DNA 产物纯化后产量应达到 60 fmol 以上方足够一次上机测序的量，可根据公式3计算或参考表3 。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
60 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

表4  不同PCR产物片段大小对应60 fmol单链环产量

PCR产物主片段大小（bp）	60 fmol对应产量（ng）
300	5.94
350	6.93
400	7.92
450	8.91
500	9.90

 

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控：Cat#12640，dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642，1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效产品。

3. 单链环质控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效产品。

3. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程

图1  通用文库转换流程

三、操作步骤

Part A接头转换PCR

1.转换PCR

该步骤对线性dsDNA文库进行转换-转化为可以进行后续环化的线性dsDNA文库。

将表5中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。

表5  转换PCR扩增反应体系

名称	体积（μL）
AC-PCR Amplification Mix	25
AC-PCR Primer Mix	1
线性dsDNA 文库
ddH2O
Total	50

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表6所示反应程序，进行PCR扩增。

表6  PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	参照注意事项中表2
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	5 min	1
4°C	Hold	–

2、转换PCR产物纯化

1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads（0.9×，Beads : DNA=0.9:1）至Adapter Ligation产物中，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，进行洗脱：加入32 μL TE buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。

9. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移30 μL上清至干净的管中。

3、转换PCR产物质检

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等转换PCR产物进行定量，具体请参见注意事项四。

Part B 转换文库环化

1 变性

1. 根据文库长度，取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中，用 TE Buffer 补充至总体积 40 μL。

4. 混匀后，在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min，之后立即置于冰上，冰浴 2 min 后瞬时离心。

2 单链环化

1. 将表7中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表7反应体系。

表7  单链环化体系

名称	体积（μL）
上一步反应物	40
App-A Splint Buffer	15
Ligase	5
Total	60

3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表8所示摄制反应程序，进行单链环化反应。

表8  单链环化反应程序

温度	时间
热盖105°C	OFF
37°C	15 min
4°C	Hold

3 酶切消化

1. 将表9中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表9所示反应体系。

表9 酶切消化体系

名称	体积（μL）
上一步反应物	60
Digestion Buffer	8
Digestion Enzyme	2
Total	70

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上，按照表10的条件进行反应：

表10  酶切消化反应程序

温度	时间
热盖105°C	OFF
37°C	10 min
4°C	Hold

5. 反应结束后，瞬时离心，立即进行纯化。

4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中，室温孵育10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约2 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置10 min。

9. 短暂离心，将 PCR 管始终置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约 2min），将上清小心移至新 PCR 管中， -20℃保存，待制备 DNB。

5 消化产物质控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量，具体请参见注意事项四。

 

HB220117