HB221128

Q：构建得到的文库产量低的原因？

A：1、DNA 质量低，样本中含抑制物（抑制酶活性等）

Input DNA 制备过程中带入的高浓度金属离子螯合剂或者其他盐，可能会影响末端修复以及A 尾添加等步骤的反应效率，DNA 在 TE 溶液中进行片段化，不要在无菌超纯水中进行。

2、RNA 污染

样本中存在 RNA 污染会导致 DNA 定量不准确，使文库构建时 DNA 上样量不足。

3、PCR free 的时候上样量不足

当使用完整接头且 Input DNA 大于 200 ng 时候，不用 PCR 扩增。如果文库拷贝数过低不能进行直接测序，可在接头连接完成后对 DNA 文库进行 PCR 扩增。

4、接头出现降解：接头存储不当会出现降解，影响连接效率。一般稀释过的接头可在室温放置 48h。判断接头是否降解的方法：

a.用安捷伦 2100 毛细血管电泳检测，通过电泳条带大小判断；如果未发生降解，则条带大小大概为 62bp（complete adapter），如果发生降解，则无条带或条带很小。

b.用 Qubit、酶标仪等检测仪器进行浓度测量，粗略判断接头是否降解。

检测方法：取 1uL，15uM 的 complete 接头（12615ES-12618ES）若 Qubit 检测浓度 600ng/ul 左右，则接头正常，反之若小于 600ng/ul，则接头可能降解成单链或小片段。酶标仪检测同理。

Q：最后一步扩增，短接头中 Primer 和长接头的 Primer 是否一致？

A：不一致。短接头建库：接头连接时候是连接一样的双端接头PE Adapter,后期进行文库扩增再利用不同的 Index Primer 扩增出完整携带不同的 DNA 文库。长接头建库：接头连接时候的连接的是带有不同 Index 的完整接头，后期扩增的时候再用两端的通用引物 Primer Mix 扩增完整的文库，使用长接头时，若在 PCR 扩增之前文库浓度就达到上机要求，则无需进行 PCR 文库扩增。

Q：接头中 index/Barcode 组合原则是什么？

A：碱基平衡，荧光平衡（详情可查看翊圣生物公众号微信软文“一文全面解析 NGS 接头的奥秘”）

产品描述

Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®是针对Illumina^®高通量文库构建专用配套试剂盒，共分为4个Set，每个Set中包含12种不同的Barcode接头，适用于Illumina^®高通量测序平台多样品DNA文库构建。试剂盒中提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度保证了文库构建的稳定性和可重复性。

产品组分

运输和保存方法

冰袋运输，-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）本试剂盒中DNA Adapter的浓度统一为15 μM，单个文库构建的接头使用量根据所用试剂盒进行调整。

2）切勿加热接头，应在室温让其缓慢溶解，实验室温度最好设置为20-25℃。接头避免反复冻融，可短暂存放于4℃。

3）小规格试剂盒（12×4 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行4个DNA文库构建，共计足够进行48个DNA文库构建，大规格试剂盒（12×16 T）每种组分的DNA Adapter包装量足够进行16个DNA文库构建，共计足够进行192个DNA文库构建。

4）使用Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®试剂盒构建的DNA文库结构如下：

5’ – Universal Adapter – Insert DNA Sequence – DNA Barcode Adapter- 3’

5）试剂盒中提供的每种DNA Adapter中都包含Universal Adapter，且提供一种Barcode序列标签，用于高通量测序时区分样品。

6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

7）本产品仅用作科研用途！

使用方法

DNA Adapter的序列如下：

Universal Adapter：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’

Barcode Adapter：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXX¹ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’

¹XXXXXX表示接头的Barcode区域，其在每个接头中的序列见下表。测序前在Sample Sheet中只需输入这个Barcode序列（6 bp）即可。

推荐Barcode组合：

2个样本：可使用（4, 6）、或（3, 19）。

3个样本：可使用（4, 6, 其他任意1个barcode）、或（3, 19, 其他任意1个barcode）、或（1, 5, 19）、或（3, 12, 15）等。

4个样本：可使用（4, 6, 其他任意2个barcode）、或（3, 19, 其他任意2个barcode）、或（3, 4, 6, 19）、或（1, 2, 5, 16）等。